構造情報に立脚した変異型IDH1/2抗体MsMab-1/-2の多重特異性の改良

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26840015
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小笠原 諭 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30546685)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: モノクローナル抗体 / 多重特異性 / X線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性中心アルギニン残基に変異が入り、酵素活性が変化することが、グリオーマの発生には重要である。これまで我々は、複数種のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性中心部位の変異を検出できる多重特異性抗体の樹立に成功している。その中でMsMab-2抗体の立体構造に着目して研究を始めている。
平成26年度はMsMab-2の結晶化実験を行うため、MsMab-2の大量生産・精製とFabフラグメント調製の検討を行ってきた。通常行っている無血清培地培養から、得られる抗体収量は1mg/L以下と非常に低いものであった。そのため、ウシ由来アルブミンの混入があるものの血清含有培地培養により精製すると、抗体収量は5mg/L以上となったためこちらを採用した。しかし、抗体濃縮すると回収率が半分程度になってしまった。次に得られた精製抗体を用いて、パパイン消化によりFabフラグメント調製の検討を行った。SDS-PAGEによる純度検定から、Fabフラグメント以外のフラグメントが確認された。さらにゲルろ過クロマトグラフィーにより分析を行うと、パパイン消化が不十分で、(Fab)'2フラグメントが混入していることが示唆された。
一方でイソクエン酸デヒドロゲナーゼの多重特異的抗体の立体構造例を増やすため、新たに抗体の樹立を行った。その結果、MsMab-2とは認識するアミノ酸が異なる多重特異性抗体MsMab-3が得られた。しかし、この抗体はペプチド抗原のみを認識する抗体であった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ハイブリドーマからMsMab-2抗体の大量生産・精製とFabフラグメントの調製の検討を行ってきたが、精製IgG抗体収量は目標値の3割（約30mg）、Fabフラグメントに至っては1割（約1mg）であり、結晶化スクリーニングまで到達していない。

Strategy for Future Research Activity

平成27年度はMsMab-2抗体の大量生産・精製とFabフラグメント調製を引き続き行い、早い段階で結晶化スクリーニングへ進む。ハイブリドーマからの生産量に関しては、これ以上の増収は見込めないため、精製以降のステップの回収率向上を目指す。特にパパインによる消化効率が低いので、添加する還元剤の検討を行って収率の改善を図る。
一方でイソクエン酸デヒドロゲナーゼの多重特異的抗体の立体構造例を増やすため、新たにMsMab-3を樹立した。このMsMab-3はペプチド抗原のみを認識する抗体ではあるが、MsMab-2とは認識するアミノ酸が異なるため、構造情報の比較としてとても興味深い。よって、MaMab-3抗体も構造解析の対象に含めることを予定している。MsMab-3は無血清培地培養で15mg/Lの収量があり、収量的には十分である。さらに、ペプチド抗原のみを認識する構造と、蛋白質を認識する構造として構造的に違いを見いだせれば、遺伝子工学的改変の一つの知見となり得ると考えている。

Causes of Carryover

結晶化実験の準備が遅れているため、必要物品の購入が遅れている。

Expenditure Plan for Carryover Budget

結晶化実験の準備ができ次第、購入を予定していた物品を購入し、結晶化実験を開始する。