根粒菌の脱窒を制御する新奇二成分情報伝達系NasS、NasTの構造機能解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26850042
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 日高 將文 東北大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (00584848)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: タンパク質工学 / 結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、根粒菌の脱窒関連遺伝子発現制御に関わるNasS、NasTタンパク質について、X線結晶構造解析によって立体構造を決定し、分子レベルにおける遺伝子発現制御メカニズムの基盤を獲得することを目的としている。NasSとNasTは、硝酸非存在下で複合体を形成している。硝酸存在下では、硝酸がNasSと結合することでNasS-NasTは解離し、遊離したNasTがmRNAと結合することでタンパク質の翻訳が促進される。本研究では、（１）NasS、（２）NasT、（３）NasS + 硝酸、（４）NasT + RNA、（５）NasS + NasTの5種類について構造解析のターゲットとしている。
平成26年度は、NasS、NasTについて大腸菌を用いた発現系・精製系のシステムを構築し、結晶化に供するタンパク質の獲得を試みた。その結果、NasSについては結晶化に供する純度のタンパク質を獲得することに成功した。NasSをタンパク質結晶化実験に供したところ、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウムを沈殿剤とする結晶化条件で結晶が得られた。この結晶を高エネルギー加速器研究機構（つくば市）のフォトンファクトリー・ビームラインNW12AでX線回折データ測定に供したところ、分解能2.55オングストロームの回折データが得られた。現在構造解析を進めている。
NasTについては、大腸菌を用いた発現・精製系では十分な量のタンパク質を獲得することができなかった。今後はより精製効率を向上させるためのアフィニティータグの付加や、安定的なタンパク質生産のためにNasSとの共発現系などを試みる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、NasS、NasTについて発現・精製系の構築から行い、（１）NasS、（２）NasT、（３）NasS + 硝酸、（４）NasT + RNA、（５）NasS + NasT、の5種類について結晶構造を明らかにすることを目的としている。平成26年度の研究で、NasSの発現系・精製系の構築と、（１）NasSの構造決定について目標を達成した。（３）NasS + 硝酸についても結晶を獲得しており、研究1年目の当初の目標を達成したと考えている。

Strategy for Future Research Activity

NasSについてはタンパク質の発現・精製系を獲得したことにより、引き続き結晶化および構造解析実験に供する。
NasTについては、安定的なタンパク質生産のために、これまでに試みた発現系・精製系を見直し、新たな手法を用いてタンパク質生産を試みる。具体的には、NasSとの共発現系の構築、アフィニティータグの検討などを考えている。安定的なNasT生産系を獲得次第、NasSとNasTの共結晶体の構造解析を目指した結晶化実験に供する。

Causes of Carryover

研究の進行の都合という点で、NasTについて、発現系・精製系の構築に至らず、当初予定していた結晶化実験に供する段階に至っていないため。また、研究実施の都合という点で、高エネルギー加速器研究機構・フォトンファクトリーが2015年1月～3月の実験が停止したため、結晶構造解析実験の機会を喪失したため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成26年度に試みたNasTの発現系の構築では、検討すべき項目が十分ではなかった可能性がある。平成27年度は、タンパク質の様々な発現・精製系を検討する。また結晶化条件の探索についても、スクリーニングキットや効率的な条件探索のための器具、機器を導入し、研究を進める。