2015 Fiscal Year Research-status Report
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26850060
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
老沼 研一 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (20635619)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 芳香族ポリマ－ / 加水分解酵素 / Aspergillus niger |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、4-ヒドロキシ桂皮酸(4HCA)と3,4-ジヒドロキシ桂皮酸(DHCA)から成る芳香族ポリエステルpoly(4HCA-co-DHCA) (4CDP)をモデル基質として、新規芳香族ポリマー分解菌および酵素を探索し、その分解機構を解明することを目的とする。更に、ポリマーの効率的リサイクル法の開発に向け、試験的なシステムを確立することを目指している。これまでに、Aspergillus niger由来の市販のペクチナーゼ試薬が、何らかの4CDP分解酵素を含有することを発見し、その精製と同定に取り組んできた。結果、目的の酵素を試薬から比活性で42倍にまで精製することに成功した。SDS-PAGEでは、主要なバンドの他、3本の比較的顕著なバンドが観察された。MALDI-TOF MS解析の結果、主要なバンドはA. niger由来の機能未知タンパク質(EHA22274)であることが示された。
上記の結果により、目的の酵素はEHA22274であることが推察されたものの、共存する他のタンパク質である可能性を排除し切れなかった。そこで、精製スキームに改良を加え、前年度の40倍量のスケールで精製を試みた結果、EHA22274をSDS-PAGE上で単一になるまで精製することに成功した。酵素活性とSDS-PAGEのバンドの出現パターンが完全に一致することから、目的の酵素はEHA22274であると結論した。次いで、Aspergillus oryzaeを宿主とした本酵素の分泌発現システムの構築に取り組んだ。A. niger ATCC 1015株から遺伝子をクローニングし、発現用プラスミドを構築した。現在、本プラスミドによるA. oryzaeの形質転換に取り組んでいる。これにより、試験的リサイクルシステムで使用可能な4CDP分解菌が作出できると見込まれる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
A. niger由来ペクチナーゼ試薬からのタンパク質精製が難航し、研究の進行にやや遅れが生じたが、最終的に、当初の計画通り、芳香族ポリマー分解酵素を精製・同定することに成功した。また、遺伝子のクローニングと発現用プラスミドの構築にも成功し、試験的リサイクルシステムの確立に必要な分解菌作出の見通しがついた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１. 4CDP分解酵素の反応機構の解析: 昨年度までにA. niger由来のペクチナーゼ試薬から精製・同定した4CDP分解酵素に対し、様々な酵素化学的検討を行い、至適反応温度・pH、基質との親和性、最大反応速度等の諸性質を明らかにする。また、分子量の小さいモデル基質や基質類似化合物を用いて、基質認識や切断様式に関する知見を得る。更に、アミノ酸配列の相同性を有する既知酵素との配列アライメントを実施し、活性アミノ酸残基に相当する部位や、共通して保存された残基に部位特異的変異を導入するなどして、既知反応との共通点を探る。これら一連の実験により、4CDP分解酵素の反応機構解明の手がかりを得る。
2. 4CDP分解菌の作出と試験的リサイクルシステムの構築: 昨年度までに構築したEHA22274発現用プラスミドをA. oryzaeに導入し、4CDP分解菌を作出する。本菌を4CDPとともに様々な条件で培養し、分解効率やモノマーの回収率等を検討する。得られたデータに基づき、実験室スケールで試験的なリサイクルシステムを構築する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度は、タンパク質精製に難航したなどの理由により、実験内容に一部変更が生じた。そこで、当初計画していた実験に必要な器具、試薬を一時買い控えたため、執行額が計画よりも低く抑えられた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前年度までの研究により、目的のポリマー分解酵素の同定に成功し、酵素の反応機構の解析に取り組む準備が整った。また、分解菌の作出に必要な発現プラスミドの構築に成功したことで、リサイクルシステムの開発に向けた試験的検討を開始する見通しがついた。平成28年度はこれら実験の実施に必要な各種の器具、試薬、キット等を購入する。具体的な内容は、実験の進行状況の変化に応じて順次決定する。
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