Screening and analysis of aromatic polymer-hydrolyzing enzymes

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26850060
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 老沼 研一 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (20635619)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 芳香族ポリマー / 加水分解酵素 / Aspergillus niger

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、4-ヒドロキシ桂皮酸(4HCA)と3,4-ジヒドロキシ桂皮酸(DHCA)から成る芳香族ポリエステルpoly(4HCA-co-DHCA) (4CDP)をモデル基質として、新規芳香族ポリマー分解菌および酵素を探索し、その分解機構を解明することを目的とする。更に、ポリマーの効率的リサイクル法の開発に向け、試験的なシステムを確立することを目指している。前年度までに、Aspergillus niger由来の市販のペクチナーゼ試薬から、4CDP分解活性を持つ酵素を高純度に精製することに成功した。MALDI-TOF MS解析の結果、本酵素はA. niger由来の機能未知タンパク質(EHA22274)であることが示された。そこで、4CDPのリサイクルシステムでの使用を見据え、Aspergillus oryzaeを宿主としたEHA22274の分泌発現系の構築を試みることとした。
平成28年度は、前年度までに構築した発現プラスミドを用いて、A. oryzaeの形質転換に取り組んだ。当該プラスミドを、プロトプラスト-PEG法によりA. oryzaeに導入し、薬剤耐性を指標に形質転換体を選択した。純化操作を経て得られた4株に対し酵素活性の検討を行った結果、4株中1株が培地中に目的の酵素を分泌していることが確認された。一方、酵素の反応機構の解析に関しては、前年度に精製した酵素標品を用いて、基質特異性の検討を行った。4HCAまたはDHCAのみから成るポリマー標品を基質として酵素アッセイを行ったところ、分解活性は認められず、EHA22274は4HCAとDHCAが連結した構造部分を特異的に切断している可能性が示唆された。また、4CDPと部分的に構造が類似した6種類の小分子化合物を用意し、これらを基質とした酵素アッセイを行ったが、いずれの化合物についても分解は認められなかった。

Research Products

• [Journal Article] Structural basis of the substrate recognition of hydrazidase isolated from Microbacterium sp. strain HM58-2, which catalyzes acylhydrazide compounds as its sole carbon source (2017)
  • Author(s): Akiyama T., Ishii M., Takuwa A., Oinuma K., Sasaki Y., Takaya N. and Yajima S.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 482 Pages: 1007-1012
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.11.148
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a novel Rhizopus-specific antigen by screening with a signal sequence trap and evaluation as a possible diagnostic marker of mucormycosis (2017)
  • Author(s): Sato K., Oinuma K., Niki M., Yamagoe S., Miyazaki Y., Asai K., Yamada K., Hirata K., Kaneko Y. and Kakeya H.
  • Journal Title: Medical Mycology Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1093/mmy/myw146
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clinical characteristics of bacteremia caused by extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli at a tertiary hospital (2017)
  • Author(s): Namikawa H., Yamada K., Fujimoto H., Oinuma K., Tochino Y., Takemoto Y., Kaneko Y., Shuto T. and Kakeya H.
  • Journal Title: Internal Medicine Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Alternative fermentation pathway of cinnamic acid production via phenyllactic acid (2016)
  • Author(s): Masuo S., Kobayashi Y., Oinuma K. and Takaya N.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: 100 Pages: 8701-8709
  • DOI: 10.1007/s00253-016-7623-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Draft genome sequence of Microbacterium sp. strain HM58-2, which hydrolyzes acylhydrazides (2016)
  • Author(s): Akiyama T., Ishige T., Kanesaki Y., Ito S., Oinuma K., Takaya N., Sasaki Y. and Yajima S.
  • Journal Title: Genome Announcements Volume: 4 Pages: -
  • DOI: 10.1128/genomeA.00554-16
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] An intrinsic strain of colistin-resistant Acinetobacter isolated from a Japanese patient (2016)
  • Author(s): Takizawa E., Yamada K., Oinuma K., Sato K., Niki M., Namikawa H., Fujimoto H., Asai K., Kaneko Y. and Kakeya H.
  • Journal Title: Internal Medicine Volume: 55 Pages: 2301-2306
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.55.6807
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genome sequence of an Acinetobacter baumannii strain carrying three acquired carbapenemase genes (2016)
  • Author(s): Oinuma K., Suzuki M., Sato K., Nakaie K., Niki M., Takizawa E., Niki M., Shibayama K., Yamada K., Kakeya H. and Kaneko Y.
  • Journal Title: Genome Announcements Volume: 4 Pages: -
  • DOI: 10.1128/genomeA.01290-16
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Two unusual cases of successful treatment of hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae invasive syndrome (2016)
  • Author(s): Namikawa H., Yamada K., Fujimoto H., Oinuma K., Tochino Y., Takemoto Y., Kaneko Y., Shuto T. and Kakeya H.
  • Journal Title: BMC Infectious Diseases Volume: 16 Pages: -
  • DOI: 10.1186/s12879-016-2011-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ゲノム情報に基づくアシネトバクター属臨床分離株の分子疫学解析 (2017)
  • Author(s): 老沼 研一, 鈴木 仁人, 佐藤 佳奈子, 中家 清隆, 滝沢 恵津子, 仁木 誠, 仁木 満美子, 山田 康一, 柴山 恵吾, 掛屋 弘, 金子 幸弘
  • Organizer: 第91回日本感染症学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2017-04-06 – 2017-04-08
• [Presentation] POT法およびMLST法によるアシネトバクター属臨床分離株の遺伝子型解析 (2017)
  • Author(s): 老沼 研一, 鈴木 仁人, 佐藤 佳奈子, 中家 清隆, 滝沢 恵津子, 仁木 誠, 仁木 満美子, 山田 康一, 柴山 恵吾, 掛屋 弘, 金子 幸弘
  • Organizer: 第51回緑膿菌感染症研究会学術集会
  • Place of Presentation: レンブラントホテル大分（大分県大分市）
  • Year and Date: 2017-02-10 – 2017-02-11
• [Presentation] 当院で血液培養より分離されたアシネトバクター属細菌の分子疫学解析 (2017)
  • Author(s): 金子 幸弘, 老沼 研一, 佐藤 佳奈子, 鈴木 仁人, 柴山 恵吾, 滝沢 恵津子, 仁木 誠, 中家 清隆, 仁木 満美子, 山田 康一, 掛屋 弘
  • Organizer: 第28回日本臨床微生物学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール, 長崎新聞文化ホール, 長崎県医師会館（長崎県長崎市）
  • Year and Date: 2017-01-20 – 2017-01-22
• [Presentation] アシネトバクター属臨床分離株の薬剤感受性試験と分子疫学解析 (2016)
  • Author(s): 老沼 研一, 佐藤 佳奈子, 鈴木 仁人, 柴山 恵吾, 滝沢 恵津子, 仁木 誠, 中家 清隆, 仁木 満美子, 山田 康一, 掛屋 弘, 金子 幸弘
  • Organizer: 第59回日本感染症学会中日本地方会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター, カルチャーリゾートフェストーネ（沖縄県宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-11-24 – 2016-11-26
• [Presentation] マウスモデルを用いた侵襲性肺ムーコル症に対する新規診断系の検討 (2016)
  • Author(s): 金子 幸弘, 佐藤 佳奈子, 老沼 研一, 仁木 満美子, 山田 康一, 山越 智, 宮崎 義継, 掛屋 弘
  • Organizer: 第59回日本感染症学会中日本地方会学術集会
  • Place of Presentation: 沖縄コンベンションセンター, カルチャーリゾートフェストーネ（沖縄県宜野湾市）
  • Year and Date: 2016-11-24 – 2016-11-26
• [Presentation] 侵襲性肺ムーコル症マウスモデルにおけるRhizopus oryzae特異的分泌抗原の有用性の検討 (2016)
  • Author(s): 佐藤 佳奈子, 老沼 研一, 山田 康一, 掛屋 弘, 金子 幸弘
  • Organizer: 第60回日本医真菌学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 東京都立産業貿易センター台東館（東京都台東区）
  • Year and Date: 2016-10-01 – 2016-10-02
• [Presentation] Aspergillus calidoustus重複感染が確認されたLichtheimia ramosaによる消化管型ムーコル症の一例 (2016)
  • Author(s): 水谷 哲, 老沼 研一, 寺地 つね子, 掛屋 弘, 金子 幸弘
  • Organizer: 第60回日本医真菌学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: 東京都立産業貿易センター台東館（東京都台東区）
  • Year and Date: 2016-10-01 – 2016-10-02
• [Presentation] 遺伝子組換え大腸菌を用いたフェニル乳酸生産に影響を与える遺伝子の発現解析 (2016)
  • Author(s): 宮川 寛規, 川口 秀夫, 荻野 千秋, 老沼 研一, 高谷 直樹, 近藤 昭彦
  • Organizer: 第68回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 富山国際会議場, ANAクラウンプラザホテル富山（富山県富山市）
  • Year and Date: 2016-09-28 – 2016-09-30
• [Presentation] Discovery and analysis of a novel Rhizopus antigen as a potential diagnostic marker for mucormycosis (2016)
  • Author(s): Oinuma K., Sato K., Niki M., Kakeya H. and Kaneko Y.
  • Organizer: 2016 International Symposium on New Frontiers in Microbiology and Biotechnology
  • Place of Presentation: 筑波大学（茨城県つくば市）
  • Year and Date: 2016-07-06
  • Int'l Joint Research / Invited