2016 Fiscal Year Research-status Report
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26860122
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
佐伯 真弓 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (00462771)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | T細胞 / PXR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度、構築したPXR発現プラスミドを、Electroporation法により細胞にトランスフェクションしたところ、PXRの発現を確認することができなかった。更に、PXRにより発現が誘導されること、T細胞に発現していることの両方が知られているMDR1の転写制御領域をルシフェラーゼ遺伝子の上流につないだレポータープラスミドと共にトランスフェクションを行い、ルシフェラーゼ活性を測定しても発現の上昇は認められなかった。そこで、PXR発現プラスミドの再構築を行った。具体的には、pEFベクターを制限酵素処理し、pEGFPのマルチクローニングサイトに挿入し、pEF-EGFPベクターを作成した。N末、C末に制限酵素サイトを付加したプライマーを用いて、初めに構築したPXRのプラスミドより、遺伝子の増幅を行った。得られたPCR産物を制限酵素処理後、pEF-EGFPに導入し、pEF-PXR-EGFPプラスミドを作成した。大腸菌に形質転換後、クローンよりプラスミドを調整した。調整したプラスミドを細胞にトランスフェクションし、その後、フローサイトメーターで蛍光強度の解析を行った。PXRをトランスフェクションした細胞では、トランスフェクションしていない細胞と比較し、蛍光強度の増加が認められた。
また、抗原特異的T細胞サブセットから、薬物代謝に関連しているPXR以外の複数の核内受容体の発現を測定したところ、遺伝子Xの発現が認められ、本遺伝子がCD4陽性T細胞の機能に関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度、構築したPXR発現プラスミドを用いて、T細胞での役割を解析する予定であったが、遺伝子発現がうまく確認されず、計画を変更して、再検討が必要となったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度、構築したPXR発現プラスミドを用いたところ、T細胞で発現が確認されたことから、T細胞におけるPXRの役割を解析する。また、再構築中に、薬物代謝に関連しているPXR以外の複数の核内受容体の発現の測定を行ったところ、ある核内受容体の発現増強が確認され、興味深い結果が得られていることから、本遺伝子についても並行して解析を行う予定である。申請者の研究室で、世界初の抗原特異的T細胞クローンマウスを作出されたことから、当初予定していたTgマウスではなく、本マウスを用いて検討を進める。
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| Causes of Carryover |
昨年度、構築したPXR発現プラスミドを用いて、T細胞での役割を解析する予定であったが、遺伝子発現がうまく確認されず、計画を変更して、再検討が必要となったことから、その予算の一部を繰り越した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養、トランスフェクション、遺伝子発現検出に必要な細胞生物学的試薬の費用
実験に必要なマウスの費用
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