Mechanism analysis of C2GnT in trophoblasts invasion

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26861323
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 新美 薫 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (20571334)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 絨毛癌 / 糖鎖 / 糖転移酵素 / hCG / C2GnT

Outline of Annual Research Achievements

絨毛性疾患及び胎盤組織におけるC2GnTの発現を検討した。臨床検体を用いて、免疫染色を行った。絨毛癌及びPSTTでは、胞状奇胎に比較して2GnTの発現は増強していた。また、絨毛癌細胞株Jar, Bewo, JEG-3, CC1, CC3, CC4, CC6およびEVT細胞株HTR-8/SVneo、さらに臨床検体の絨毛性疾患組織と胎盤検体の一部から蛋白およびmRNAを抽出し、それぞれウエスタンブロットおよびRT-PCRにて発現量を評価したところ、絨毛癌細胞株でC2GnTは強発現していたが、正常胎盤および胞状奇胎では発現が弱かった。また、細胞株の培養上清におけるregular hCGとC2GnTが付加する糖鎖が修飾されたhCGであるH-hCGを測定した。絨毛癌細胞株Jar, Bewo, JEG-3のmRNA発現強度とH-hCGのhCGにおける割合は相関していた。
絨毛癌細胞株JarにC2GnT siRNA遺伝子導入を行い、C2GnT発現抑制が及ぼす機能変化を解析した。増殖能はMTSassayで、運動能をトランスウェルチャンバー法で、浸潤能をマトリゲルトランスウェルチャンバー法で評価した。運動能は変化はなかったが、C2GnT発現抑制により、運動能および浸潤能は抑制された。また、Fibronectin, CollagenI, Collagen IVへの接着能はC2GnT発現抑制により有意に低下した。
in vivo実験を行うために永久的なノックダウン細胞株を作成することを試みた。CRISPR-Cas9を用いてC2GnTノックアウト細胞を作成することとした。Lipofectamine2000を用いてGCNT1のCRISPR-Cas9 plasmidを絨毛癌細胞株Jar及びBewoにtransfectionする予定である。
siRNAを用いたC2GnT発現抑制細胞を用いて、血管内皮への接着能を確認した。HUVECへの接着はC2GnT発現抑制により有意に低下した。