2015 Fiscal Year Annual Research Report
クエン酸指示薬として開発したGFP融合タンパク質の蛍光強度変化機構の解析と改良
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26870429
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
本田 裕樹 九州大学, カーボンニュートラル・エネルギー国際研究所, 学術研究員 (90583849)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛍光クエン酸指示薬 / 蛍光タンパク質 / クエン酸 / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クエン酸はあらゆる生物において検出される主要な代謝中間産物である。中央代謝の制御に関わる他、一部のがん細胞において通常細胞とのクエン酸濃度に差があることや泌尿器系疾患において尿中クエン酸濃度のマーカーとしての利用可能性が指摘されているなど、クエン酸の細胞内および細胞外での濃度変化を迅速に検出する技術は有用であると考えている。申請者は、クエン酸濃度を迅速かつ簡便な精密定量を可能とする蛍光タンパク質センサーの開発を目的として、環状異性化変異を加えたGFPをクエン酸との結合により構造変化する細菌由来クエン酸センサータンパク質内へ挿入した融合タンパク質（環状異性化GFPの挿入位置によりCF98、CF99と命名）を作製し、その蛍光クエン酸指示薬としての詳細な機能評価および性能向上について検討した。CF98とCF99と命名した２つのクエン酸蛍光タンパク質センサーは、一次構造としては環状異性化GFPの挿入位置が１アミノ酸分ずれているのみである。一次構造の差異が小さいにも関わらず、CF98ではクエン酸濃度の応答範囲は0.05 mMから50 mMでクエン酸濃度の上昇に伴って蛍光強度が増大する性質を示し、CF99は応答範囲0.05 mMから5 mMでクエン酸濃度の上昇に伴って蛍光強度が減少する性質を示した。CF98の濃度応答範囲は、既報の細胞内クエン酸濃度の検出に適しており、一方CF99はより鋭敏な感度を示し各種溶液中での微量定量に適していた。CF98については大腸菌やクエン酸生産糸状菌内のクエン酸濃度変化の検出へと適用した。CF99については、実サンプルへの応用を志向してジュースや酒などのクエン酸濃度の検便な検出への適用可能性を探った。クエン酸指示薬としての機能向上を目指していくつかの変異体を作製し、これらのクエン酸応答範囲が変化するものを取得した。
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