ヒトクロマチンDNAの試験管内複製系の確立とその制御機構

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 61480128
• Research Institution: Laboratory of Cancer Cell Biology, Research Institute for Disease Mechanism and Control, Nagoya University School of Medicine
• Principal Investigator: 吉田 松年 名古屋大学, 医学部, 助教授 (70090420)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小泉 恵子 名古屋大学, 医学部, 講師 (00118027) ; 小島 清秀 名古屋大学, 医学部, 教授 (80073104) ; 伊豆田 俊二 名古屋大学, 医学部, 助手 (50203047)
• Keywords: 試験管内DNA複製系 / 自律増殖配列 / DNAポリメラーゼα / トポイソメラーゼI / cーmycタンパク / ゲルシフトアッセイ

Research Abstract

前年度までに試験管内ヒトDNA複製系を確立した。DNAとしてはヒトCーmyc遺伝子上流に存在する自律増殖配列(ARS)を組み込んだプラスミドDNAを用い、酵素源としてはヒト悪性リンパ腫Raji細胞核抽出物を用いた。この系によるDNA複製反応に対して酸性リン脂質、特にフォスファチジルイノシトールおよびカルジオリピンが強い阻害効果を示した。この効果はこれらリン脂質がトポイソメラーゼIおよびDNAポリメラーゼαと相互作用をする事によると思われる。さらに我々は複製に関与する酵素およびタンパク因子を明らかにする目的で以下の解析を行った。
(1)Raji細胞核抽出物を硫安分画により30%、50%、70%飽和の3画分に分けると複製活性は50%に回収された。この画分にはDNAポリメラーゼα・プライマーゼ複合体、トポイソメラーゼIIの大部分が回収されるが、トポイソメラーゼIは70%画分に強い活性を示した。モノクローナル抗体でポリメラーゼαを除去すると複製活性は失われ、それにα酵素を加えると活性は回復した。α酵素に対する特異的阻害剤アフィディコリンが複製活性を強く抑制することと考え合わせ、この複製系ではDNAポリメラーゼαが主として関与していることが示された。
(2)ARSのうち必須領域と考えられる30塩基対のDNA断片を化学合成し、その配列に特異的に結合するタンパクを分離した。検出にはゲルシフト法を用い、DNAアフィニティーカラムにより分子量47K又は68Kのタンパクが単離され、これらはウエスタン・ブロット法により抗cーmyc抗体と反応する事からcーmycタンパクと考えられる。このタンパクが複製において果す役割について検討中である。

Research Products

• [Publications] Suzuki,R.;Masaki,S.;Koiwai,O.;Yoshida,S.: Journal of Biochemistry. 99. 1673-1679 (1986)
• [Publications] Abbots,J.;Nishiyama,Y.;Yoshida,S.;Loeb,A.: Nucleic Acids Research. 15. 1185-1198 (1987)
• [Publications] Tanaka,M;Kimura,K.;Yoshida,S.: Cancer Research. 47. 5971-5974 (1987)
• [Publications] Fujisawa,M.;Matsumoto,O.;Kamidono,S.;Hirose,F.;Kojima,K.;Yoshida,S.: Jounal of reproduction and fertility. 84. 123-130 (1988)
• [Publications] Tamai,K.;Kojima,K.;Hanaichi,T.;Suzuki,M.;Umekawa,H.;Masaki,S.;Yoshida,S.: Biochimica et Biopysica Acta. 950. 263-273 (1988)
• [Publications] Hotta,Y.;Fujisawa,M.;Tabata,S.;Stern,H.;Yoshida,S.: Experimental Cell Research. 178. 163-168 (1988)
• [Publications] Fujisawa,M.;Yoshida,S.;Matsumoto,O.;Kojima,K.;Kamidono,S.: Archives of Andrology. 21. 45-50 (1988)
• [Publications] Fujisawa,M.;Yoshida,S.;Matsumoto,O.;Kojima,K.;Kamidono,S.: Fertility and Sterility. 50. 795-800 (1988)
• [Publications] Nagasaka,A.;Yoshida,S.;Nakai,A.;Ohmiya,T.;Iwase,K.;Ohtani,S.;Shinoda,S.;Masunaga,R.;Nakagawa,H.: Metabolism. 37. 1051-1054 (1988)
• [Publications] Takagi,E.;Kawatsu,H.;Shimokata,K.;Nishiyama,Y.;Kojima,K.;Yoshida,S.: Japanese Journal of Cancer Research(Gann). 79. 938-944 (1988)
• [Publications] Umekawa,H.;T-Koizumi,K.;Takagi,E.;Ariga,H.;Kojima,K.;Yoshida,S.: Journal of Biochemistry. 104. 333-336 (1988)
• [Publications] Yoshida,S.;T-Koizumi,K.;Kojima,K.: Biochimica et Biopysica Acta. 1007. 61-66 (1989)