AchromobacterプロテアーゼIの触媒特性と安定性の基盤解析

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62480451
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 崎山 文夫 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (40029947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 乗岡 茂巳 大阪大学, 蛋白質研究所, 助手 (70198638)
• Keywords: プロテアーゼ活性 / リジン特異的酵素 / サブサイト / サブサイトマッピング / 発蛍光性基質

Research Abstract

7ーアミノー4ーメチルクマリン(AMC)をリジンのカルボキシル基に連結させて作製されたLysーMCAはプロテアーゼによるペプチド結合の切断に放出する蛍光の波長が変化する。この性質を利用してリジンのカルボキシル基側を特異的に加水分解するAchromobacterプロテアーゼI(API)の触媒活性を微量に測定できる。そこで、種々の長さのペプチド鎖をもつ発蛍光性基質XーLysーMCAを合成してAPIのサブサイトの大きさと性質を検索しようと試みた。
Boc-Lys-MCAのアミノ基側にアミノ酸残基を1つ付加した基質Boc-AA-Lys-MCA(AA=アミノ酸)を合成してAPIの触媒活性をBoc-Lys-MCAのそれと比較したところ、Km値の減少とkcat値の増加によりkcat/Km値がほぼ2桁増加した。さらにアミノ酸1残基付加すればKm値は殆ど変化しなかったが、kcat値の増加によりkcat/Km値が幾分上昇した。以上の結果から、APIの触媒部位近傍には3つのサブサイトS_1、S_2、S_3が存在すると結論づけられた。
ほ乳類型セリンプロテアーゼには基質の加水分解を受けるペプチド結合よりアミノ基側の残基と相互作用する3つのサブサイトS_1、S_2、S_3が存在し、微生物型セリンプロテアーゼにはさらにサブサイトS_4が存在する。APIのサブサイトの個数とアミノ酸配列の類似性よりAPIがほ乳類型セリンプロテアーゼに属すると考えられる。
2つの基質Boc-AA-AA-Lys-MCAとH-AA-AA-Lys-MCAに対するAPIの触媒活性の比較より、APIにはサブサイトS_4は存在しないが、疎水性基と相互作用する部位がS_4近傍に存在すると推測される。

Research Products

• [Publications] Susumu Tsunasawa: The Journal of Biological Chemistry. 264. 3632 (1989)
• [Publications] Masaya Suzuki: The Journal of Biochemistry.
• [Publications] Akira Yamamoto: The Journal of Biochemistry.
• [Publications] 崎山文夫: "蛋白質工学入門" 崎山文夫, 1-30 (1987)
• [Publications] 山崎文夫: "タンパク質工学" 小野修一郎, 121-138 (1989)