脳内オピオイドペプチドの高選択的高感度HPLCの開発

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 62570969
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 大倉 洋甫 九州大学, 薬学部, 教授 (00037574)
• Keywords: オピオイドペプチド / エンケファリン / N末端チロシン含有ペプチド / 脳 / 高速液体クロマトグラフィー / 高選択的蛍光反応 / 蛍光検出 / 高感度分析

Research Abstract

生体内に存在するモルヒネ様(オピオイド)ペプチドは、アミノ酸配列のN末端にチロシル残基を有する、本研究では、当研究代表者らが既に発見しているN末端チロシン含有ペプチド類に極めて高選択的な新しい蛍光反応をHPLCのプレカラム蛍光誘導体化反応に適応し、蛍光検出HPLCによりラット脳内のオピオイドペプチド〔leucine enkephalin(LEK),methionine enkephaline(MEK),MEK-Arg-PheおよびMEK-Arg-Gly-Leu〕の一斉定量法を開発した。
1.試料の調整:脳組織を0.1M HCLでホモジネートする、HC10_4を加え除蛋白し、得られる上清を逆相分配型のミニカートリッジに注ぐ、カラムに保持されたオピオイドペプチドをメタノール-0.2Mホウ酸塩緩衝液(pH8.5)(8:2,v/v)で溶出し、減圧下溶媒を留去する。
2.蛍光誘導体化反応とHPLC:ホウ酸塩緩衝液(pH8.5)を含むペプチド試料60μlに5mMシュウ酸ヒドロキシルアミン-0.5mM酢酸コバルト(II)溶液を加え、100℃3分間加熱する。生成したペプチドの蛍光体を逆相HPLC〔カラム、Asahipak ODP-50(150X6mmi.d.、粒径5μm):溶離液、10mMホウ酸塩緩衝液を含むアセトニトリル;溶離、2-50%(v/v)アセトニトリルのグラジェント勾配;流速、1.0ml/min;検出、励起波長340nmおよび発光波長435nm〕により分離・検出する。
14種の標品オピオイドペプチド(分子量500-2000)の蛍光体はシリカゲル担体の逆相カラムより合成硬質ポリマー担体の逆相カラムにより良好に分離・溶出し得ることが分かった。この蛍光検出HPLCにより、ラット脳の線条体中のLEK、MEK、MEK-Arg-PheおよびMEK-Arg-Gly-Leuの一斉定量が可能になった。また、開発した選択的蛍光プレカラムHPLCを利用すれば、生体内のオピオイドペプチドを種々のペプチダーゼの酵素分解によって容易に同定できることも明らかにした。

Research Products

• [Publications] Mutsuko Nakano.: Journal of Chromatography. 411. 305-311 (1987)
• [Publications] Masaaki Kai.: Analytical Sciences.
• [Publications] Guo-Qing Zhang.: Journal of Chromatography.