1989 Fiscal Year Annual Research Report
ColE2およびColE3プラスミドDNA複製開始の分子機構
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63480510
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
伊藤 建夫 大阪大学, 理学部, 助教授 (40051817)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀井 俊宏 大阪大学, 理学部, 助手 (80142305)
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| Keywords | コリシンE2 / コリシンE3 / 複製開始蛋白 / 複製開始部位 / プラスミド特異性 / 一方向複製 / プライマ-RNA |
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| Research Abstract |
ColE2およびColE3DNA複製系を用いて、プラスミド特異的複製開始蛋白(Rep)によるDNA複製開始反応の分子機構の解明を試みた。以下に本年の研究経過および今後の研究の展開についての計画を記す。
1.分離用小型超遠心機を用い、多種類のプラスミドDNAを極めて迅速に精製し得るので、種々の変異プラスミドの純化されたDNAを用いる精度の高い実験を遂行できた。2.Rep蛋白のプラスミド特異性決定に関与している領域をさらに縮め、約20アミノ残基を含む領域内に限定した。3.試験管内DNA複製を用いて、最初に複製開始点付近から合成されるleading鎖成分のDNA断片を同定し、その5'末端の位置を塩基配列上に正確に決定した。また、lagging鎖成分のDNA断片を同定し、その3'末端の位置を決定した。4.leading鎖成分のDNA断片の5'末端にRNAが付着していることを見出した。プライマ-RNAの残存物と考えられる。このRNAの構造を解析中である。5.このプライマ-RNAの形成には、宿主大腸菌のRNA合成酵素(転写酵素およびプライマ-合成酵素)が関与していないことを示唆する結果を得た。Rep蛋白がRNAを合成している可能性を検討している。6.Rep蛋白の機能の詳細を解明するため、この蛋白の精製を試みた。少なくともKClなどの高塩濃度下(1M以上)では可溶化出来るので、ある程度純度を上げることに成功した。蛋白の精製には紫外吸収モニタ-を繁用している。さらに、グルタミン酸カリウム溶液を用いると低塩濃度下(50mM以下)でも可溶化できることを見出したので、種々のイオン交換樹脂を利用する可能性が開けた。7.15種の近縁プラスミドの中からRep蛋白のプラスミド特異性の異なる2グル-プのプラスミドを見出した。Rep蛋白のプラスミド特異性決定機構の解明に利用できると期待される。
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[Publications] Toshihiro Horii: "Replication of ColE2 and ColE3 plasmids:The regions sufficient for autonomous replication." Molecular and General Genetics.212. 225-231 (1988)
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[Publications] Yoshitaka Tajima: "Replication of ColE2 and ColE3 plasmids:Two ColE2 incompatibility functions." Molcular and General Genetics.214. 451-455 (1988)
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[Publications] Hisashi Yasueda: "Structural and functional organizations of ColE2 and ColE3 replicons." Molcular and General Genetics.215. 209-216 (1989)
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[Publications] Tateo Itoh: "Replication of ColE2 and ColE3 plasmids:In vitro replication system dependent on plasmid-coded proteins." Molcular and General Genetics.219. 249-255 (1989)
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[Publications] Mitsuru Kido: "Identification of a plasmid-coded protein required for intication of ColE2 DNA replication."
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[Publications] Hisashi Yasueda: "Control of ColE2 plasmid replication;Regulation of Rep expression at post-transcriptional step."
