水痘生ワクチンウイルスをベクターとするレコンビナント生ワクチンの開発

1988 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 63870023
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高橋 理明 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (50029758)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 厳 大阪大学, 微生物病研究会, 品質管理部長 ; 白木 公康 大阪大学, 微生物病研究所, 助手 (50135745) ; 山西 弘一 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (10029811)
• Keywords: レコンビナント水痘帯状疱疹ワクチニアウイルス / 水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子 / B型肝炎ウイルス表面抗原(HBs)遺伝子

Research Abstract

水痘ワクチンウイルス(岡株)のチミジンキナーゼのゲノムにB型肝炎S抗原(HBs)ゲノムを導入する研究は成功しHBs+PreS(アミノ酸9コ)及びHBs+PreS(アミノ酸25コ)をTKゲノムの上流に挿入できた。このベクターをヒト細胞にトランスフェクトさせアシクロビル(ACV)を用いこれによる増殖阻害をうけないウイルス株を得ることを試みたが、蛍光抗体陽性クローンは得ることができなかった。このようにトランスフェクトによる分離は水痘ウイルスのトランスフェクションの効率が悪いことがわかったので更に以下の2つの方法にてリコンビナントの分離を試みた。Cell freeウイルスを作製する際、感染細胞浮遊液中にHBsDNAを含むプラスミド1mg/mlを加え凍結融解後低速遠心上清をHEL細胞に感染させた。そしてACV(100μM)を加え更に培養後HEL細胞に感染させCPE出現後Cell free virusを作製した。このCell free virusをACV100μM存在下で培養しACV抵抗株31株を得た。そのうち1株は蛍光抗体法でHBs抗原陽性HBsDNAの存在をDot blot法にて確認した。しかしこの株を更に3代継代したところ蛍光抗体法Dot Blot法両者共陰性となった。次に感染細胞培養液にHBsDNAプラスミドを1mg/ml加え感染細胞及びその周辺細胞の核にプリッキング法を用いてDNAを注入し24時間後Cell to Cell感染を行い継代2代目にHBs抗原陽性コロニーを蛍光抗体法にて5ケ確認したが更に2代継代したところ陽性クローンを認めなくなった。
以上のように現在まで得られているHBsDNAを含むリコンビナントは不安定であり継代に伴いHBsDNAを失うものと思われる。今後はCell-Sorterを用い抗原陽性細胞の多いフラクションを集めlimiting dilutionの方法などにより安定なリコンビナント株を得ることを計画している。

Research Products

• [Publications] Mori,H.;Shiraki,K.;Kato,T.;Hayakawa,Y.;Yamanishi,K.;Takahashi,M.: Intervirology. 29. 301-310 (1988)