2016 Fiscal Year Annual Research Report
光活性化を利用した[NiFe]ヒドロゲナーゼの触媒反応機構の分光学的研究
Publicly Offered Research
| Project Area | Stimuli-responsive Chemical Species for the Creation of Functional Molecules |
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| Project/Area Number |
15H00945
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
廣田 俊 奈良先端科学技術大学院大学, 物質創成科学研究科, 教授 (90283457)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 酵素 / 光活性化 / 赤外分光法 / ヒドロゲナーゼ / 金属蛋白質 / 反応機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
標準型[NiFe]ヒドロゲナーゼは酸化型で安定であり、酸塩基平衡により活性準備状態Ni-SIrが触媒サイクルの1つの状態であるNi-SIaに変換され、触媒反応（H2の分解/合成）が可能となる。したがって、本酵素の触媒反応機構の理解には、Ni-SIrからNi-SIaへの変換機構の理解が不可欠であるが、その変換機構の詳細は不明であった。本年度は、103－238 Kでレーザー光(514.5 nm)照射下のFT-IRスペクトルを測定することで、Ni-SIrとNi-SIa間の酸塩基平衡の反応機構を明らかにした。まず、好気的に精製した酵素を37℃でH2と5.5時間反応させることでH2還元型酵素を調製した。次に、H2還元型酵素を5当量のフェノサフラニン(Em = －252 mV)を用いて部分的に酸化させ、主にNi-SIrとNi-SIaを含むフェノサフラニン酸化型酵素を調製した。フェノサフラニン酸化型酵素の（光照射時）－（光照射前）のFT-IR差スペクトルには、Ni-SIaのCO伸縮振動（νCO：1943 cm－1）とCN－伸縮振動（νCN：2077と2089 cm－1）に由来する正のピークおよびNi-SIrのνCO（1924 cm－1）とνCN（2056と2071 cm－1）に由来する負のピークが観測された。差スペクトルにおける正のピークは生成物、負のピークは反応物に由来し、Ni-SIrがNi-SIaに光活性化されることが明らかとなった。さらに、溶液のpHを8.0から9.6に上げるとNi-SIrの光活性化が著しく抑制されたことから、この光活性化反応ではNiとFe間の架橋配位子OH－がプロトン化され、H2O分子として解離すると解釈した。また、酵素反応を追跡するためのストップトフロー共鳴ラマン装置を開発した。これらの研究成果は[NiFe]ヒドロゲナーゼの反応機構の理解に役立つものである。
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| Research Progress Status |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Presentation] Structural and Biochemical Studies of Hyd-2 Type [NiFe]-hydrogenase from Citrobacter sp. S-77 - Proposal of the General Mechanism of O2-tolerance of Hydrogenases2016
Author(s)
Y. Higuchi, N. D. M. Noor, H. Matsuura, K. Nishikawa, H. Nishihara, K-S. Yoon, S. Ogo, H. Tai, S. Hirota, and Y. Shomura
Organizer
11th International Hydrogenase Conference (Hydrogenase 2016)
Place of Presentation
Marseille, France
Year and Date
2016-07-10 – 2016-07-14
Int'l Joint Research / Invited
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