発癌シグナルにおけるK63型と直鎖状ポリユビキチン鎖の機能的クロストークの解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
• Project/Area Number: 15H01176
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 井上 純一郎 東京大学, 医科学研究所, 教授 (70176428)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: シグナル伝達 / 癌

Outline of Annual Research Achievements

Nuclear factor-kB (NF-kB) は炎症性サイトカイン、ケモカイン、抗アポトーシス分子、増殖因子などの発現を制御する転写因子で、炎症反応、免疫応答、細胞分化や増殖といった様々な生命現象に関与している。一方で、制御異常による恒常的なNF-kB活性化は炎症性疾患やがんの原因となることが知られており、ヒトT細胞白血病ウイルスI (HTLV-1)の Taxタンパク質は恒常的なNF-kB活性化を誘導して細胞の不死化を引き起こし成人T細胞白血病を発症させると考えられている。Taxタンパク質によるNF-kB活性化の分子機構について無細胞系を用いて1) 鎖型特異的な脱ユビキチン化酵素を用いた解析、2) ユビキチンのリシン残基をアルギニンに置換した変異体を用いた解析を実施し以下の点を明らかにした。
１）活性化にはK27型、K63型、直鎖状ユビキチン鎖の合成が必要である。２）K63型ユビキチン鎖の合成にはUbc13がE2として機能する。３）活性化には直鎖状ユビキチン鎖合成複合体(LUBAC)が必須である。４）Taxを介してLIUBACはIKK複合体に結合し、LUBAC/Tax/IKKからなる複合体を形成する。この複合体形成にユビキチン化は必要ない。５）質量分析からTax依存的にIKK複合体にK63型及び直鎖状ユビキチン鎖が結合していることが明らかになった。
以上の結果から、LUBAC/Tax/IKK複合体がTaxにより合成されたユビキチン鎖によりさらに大きなマクロ複合体になりIKKが活性化するモデルを提唱した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに我々や他のグループからK63型ユビキチン鎖がTaxによるNF-kB活性化に必要であることが報告されていたが、我々は加えてK27型や直鎖状ユビキチン鎖が必要であることを明らかにした。また、不活性化型のLUBAC/Tax/IKK複合体形成にユビキチン反応は必要としないが、活性化型のマクロ複合体形成にはK63型及び直鎖状両者のユビキチン鎖が必須であることを世界で初めて明らかにした。一方、K63型ユビキチン鎖形成にUbc13が必須であることは示したがE3酵素については同定できなかった。今後はマクロ複合体をさらに解析しE3酵素を探索する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

１）多くのサイトカインシグナルにおいてK63型ユビキチン鎖合成のE3であるTRAF6と直鎖状ユビキチン鎖合成であるLUBACは協調してNF-kBを合成している。しかし、協調の分子機構には不明な点が多い。我々はすでに無細胞系でのTRAF6によるNF-kB活性化系を確立しているので初めにHOIL-1Lノックアウト細胞でのTRAF6によるNF-kB活性化を検討する。反応系にK63R-Ub,HA-Ubや種々のDUBを添加しNF-kB活性化への影響を解析するとともにTRAF6,IKK,LUBACを免疫沈降しK63型。直鎖状ユビキチン鎖依存的なマクロ複合体形成や結合タンパク質変化を解析する。以上の実験結果からTRAF6とLUBACが協調するシグナルにおける異鎖間クロストークを解明する。
２）悪性度の高いBasal-like乳癌では、恒常的なNF-kB活性化が癌幹細胞の増殖維持に関与することを報告している。そこで乳癌細胞の破砕液を用いた無細胞系システムで恒常的NF-kB活性化の分子機構を解明する。

Research Products

• [Journal Article] Integrative Network Analysis Combined with Quantitative Phosphoproteomics Reveals TGFBR2 as a Novel Regulator of Glioblastoma Stem Cell Properties. (2016)
  • Author(s): Narushima, Y., Kozuka-Hata, H., Koyama-Nasu, R., Tsumoto, K., Inoue, J, Akiyama, T., Oyama, M
  • Journal Title: Mol. Cell. Proteomics Volume: 15 Pages: 1017-1031
  • DOI: 10.1074/mcp.M115.049999
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative phosphoproteomics-based molecular network description for high-resolution kinase-substrate interactome analysis. (2016)
  • Author(s): Narushima, Y., Kozuka-Hata, H., Tsumoto, K., Inoue, J. and Oyama, M.
  • Journal Title: Bioinformatics Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1093/bioinformatics/btw164.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Catalytic subunits of the phosphatase calcineurin interact with NF-kB-inducing kinase (NIK) and attenuate NIK-dependent gene expression. (2015)
  • Author(s): Shinzawa. M., Konno, H., Qin, J., Akiyama, N., Miyauchi, M., Ohashi, H., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H., Akiyama, T.* and Inoue, J.
  • Journal Title: Sci. Rep Volume: 5 Pages: 10758
  • DOI: 10.1038/srep10758
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Visualization of RelB expression and activation at the single-cell level during dendritic cell maturation in Relb-Venus knock-in mice. (2015)
  • Author(s): Seki, T., Yamamoto, M., Taguchi, Y., Miyauchi, M., Akiyama, N, Yamaguchi, N., Gohda, J., Akiyama, T. and Inoue, J
  • Journal Title: J. Biochem Volume: 158 Pages: 485-495
  • DOI: 10.1093/jb/mvv064
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Loss of Tifab, a del(5q) MDS gene, alters hematopoiesis through derepression of Toll-like receptor-TRAF6 signaling (2015)
  • Author(s): Varney, M.E., Niederkorn, M., Konno, H., Matsumura, T., Gohda, J., Yoshida, N., Akiyama, T., Christie, S., Fang, J., Miller, D., Jerez, A., Karsan, A., Maciejewski, J.P., Inoue, J. and Starczynowski, D.T.
  • Journal Title: J. Exp. Med Volume: 202 Pages: 1967-1985
  • DOI: 10.1084/jem.20141898
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hypergravity provokes a temporary reduction of CD4+CD8+ thymocytes and a persistent decrease in medullary thymic epithelial cell frequency in mice. (2015)
  • Author(s): Tateishi, R., Akiyama, N., Miyauchi, M., Yoshinaga, R., Sasanuma, H., Kudo, T., Shimbo, M., Shinohara, M., Obata, K., Inoue, J., Shirakawa, M., Shiba, D., Asahara, H., Yoshida, N., Takahashi, S., Morita, M. and Akiyama, T.
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 10(10) Pages: e0141650
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0141650
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Visualization of RelB expression and activation at the single-cell level during dendritic cell maturation in Relb-Venus knock-in mice (2016)
  • Author(s): 関崇生、山本真実、田口祐、宮内真紀、秋山伸子、山口憲孝、合田仁、秋山泰身、井上純一郎
  • Organizer: American Association for Cancer Research
  • Place of Presentation: Whistler Conference Centre（カナダ バンクーバー）
  • Year and Date: 2016-03-13 – 2016-03-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of HTLV-1 Tax-induced IKK activation pathway (2016)
  • Author(s): 柴田佑里、井上純一郎
  • Organizer: American Association for Cancer Research
  • Place of Presentation: Whistler Conference Centre（カナダ バンクーバー）
  • Year and Date: 2016-03-13 – 2016-03-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TRAF6 regulates pregnancy-induced mammary gland development and maintenance of epithelial stem cells (2016)
  • Author(s): 山本瑞生、井上純一郎
  • Organizer: Keystone symposia Stem Cells and Cancer (C1)
  • Place of Presentation: Beaver Run Resort（米国 コロラド州）
  • Year and Date: 2016-03-06 – 2016-03-10
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Stimulation-dependent internalization of RANK is crucial for differentiation of osteoclast involved in bone metastasis (2016)
  • Author(s): 田口祐、井上純一郎
  • Organizer: Breakthroughs in Cancer Research:from Biology to Therapeutics
  • Place of Presentation: Hyatt Regency Maui（米国 ハワイ州）
  • Year and Date: 2016-02-16 – 2016-02-20
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 非古典的NF-κB経路の振動は標的遺伝子の転写を制御する (2015)
  • Author(s): 関崇生、田口祐、秋山泰身、井上純一郎
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 妊娠期の乳癌成熟および幹細胞維持におけるTRAF6の役割 (2015)
  • Author(s): 山本瑞生、井上純一郎
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 転写因子NF-κBの制御メカニズムとその生理機能 (2015)
  • Author(s): 井上純一郎
  • Organizer: 数理医学研究会 第51回数理医学セミナー
  • Place of Presentation: 大阪大学（大阪府豊中市）
  • Year and Date: 2015-11-25 – 2015-11-25
  • Invited
• [Presentation] Regulation of the TRAF-NF-κB and the Calcineurin-NFATc1 pathways in RANK signal-induced osteoclastogenesis (2015)
  • Author(s): 井上純一郎
  • Organizer: East Asia joint symposium
  • Place of Presentation: Oist Campus（沖縄県国頭郡）
  • Year and Date: 2015-11-11 – 2015-11-14
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 乳癌における細胞間相互作用による上皮感葉転換の制御 (2015)
  • Author(s): 山本瑞生、井上純一郎
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際センター（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] HTLV-1Tax誘導性のIKK複合体活性化におけるポリユビキチン鎖の機能解析 (2015)
  • Author(s): 柴田佑里、井上純一郎
  • Organizer: 日本HTLV-1学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京大学医科学研究所（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-08-22 – 2015-08-23
• [Presentation] 刺激依存的な受容体RANKの細胞質内局在化が果たす破骨細胞分化における役割 (2015)
  • Author(s): 田口祐、井上純一郎
  • Organizer: 日本骨代謝学会学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25
• [Presentation] 破骨細胞の分化成熟におけるTRAF6の役割 (2015)
  • Author(s): 弓桁洋、田口祐、井上純一郎
  • Organizer: 日本骨代謝学会学術集会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都新宿区）
  • Year and Date: 2015-07-23 – 2015-07-25