2015 Fiscal Year Annual Research Report
ユビキチンが形成するT細胞抑制性シグナルソームの分子イメージング解析
Publicly Offered Research
| Project Area | New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation |
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| Project/Area Number |
15H01194
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
横須賀 忠 東京医科大学, 医学部, 教授 (10359599)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 免疫学 / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
T細胞が活性化する際、抗原提示細胞と接着し、抗原ペプチドとMHCの情報を受け取る。その際、2つの細胞の接着面は「免疫シナプス」と呼ばれ、T細胞受容体(TCR)とその下流のシグナル伝達分子から成る凝集塊「TCRマイクロクラスター」で構成される二次元平面である。TCRマイクロクラスターは活性化の単位でもあるが、抑制性分子が会合することや、最終的にインターナリゼーションされることから、シグナル終焉の単位とも考えられる。本課題研究では、TCRのインターナリゼーション・分解に重要なE3ユビキチンリガーゼc-ClbおよびCbl-bを可視化し、TCRシグナル終焉のメカニズムを明らかにすることを目的とした。
1)ユビキチンのイメージング解析：Cblファミリー分子とユビキチンを可視化するため、それぞれの分子とのGFPキメラ分子を作製し、免疫シナプス内でTCRと共にクラスターを形成することを示した。
2)エンドサイトーシス分子との関連性の解析：クラスリン依存的エンドサイトーシス経路との関連性を示すため、クラスリン軽鎖、ダイナミン、エンドサイトーシス蛋白EPS15の挙動をイメージングし、それらがTCR直下のシグナル伝達分子が会合するより30秒遅く、TCRマイクロクラスターにリクルートすることを明らかにし、TCRシグナル活性化に対するネガティブフィードバックの過程であると考えられる。
3)特異的ユビキチン鎖の同定：TCRマイクロクラスターに凝集するユビキチンが、K63優位であることを、特異的ユビキチン鎖に対する抗体にて同定した。
4)遺伝子欠損マウスを用いたイメージング解析：Cblファミリー分子の遺伝子欠損マウス由来から末梢T細胞を調整し、TCRのエンドサイトーシスとユビキチン化をイメージングした。その結果、Cbl-b依存的にK63ユビキチン修飾とTCRのエンドサイトーシスが誘導されることを発見した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TCRマイクロクラスター、E3ユビキチンリガーゼおよびユビキチンの同時イメージングに成功し、これまで生化学でしめされていたTCRのインターナリゼーションと分解の減少を追従し、さらにその新たなメカニズムの解明に至り、本年度の研究実施計画を沿った実験が行うことが出来ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
特異的ユビキチン結合のイメージングを、特異的抗体だけでなく、2015年に4報報告された特異的ユビキチン血追うのイメージングプローブを使い、また、まだ報告されていないK48結合のプローブを作製し、本年度のデータの正当性を再評価する。また、本年度は末梢T細胞に関する研究を進めたが、Cblファミリーの機能的差があると考えられている中枢（胸腺）T細胞のCbl分子およびユビキチンの可視化を行い、末梢T細胞を比較することで、一般に自己免疫に関わるとされるCblファミリー分子の疾患発症機序の解明へと繋げる。
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