2021 Fiscal Year Annual Research Report
Prenatal stress at critical period induces odd cholinergic projections to cortical GABA system
Publicly Offered Research
| Project Area | Inducing lifelong plasticity (iPlasticity) by brain rejuvenation: elucidation and manipulation of critical period mechanisms |
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| Project/Area Number |
21H05687
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
福田 敦夫 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50254272)
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| Project Period (FY) |
2021-09-10 – 2023-03-31
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| Keywords | GABA / アセチルコリン / 細胞発生 / Gad1 / 胎生ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．臨界期ストレス胎仔脳の遺伝子発現解析：妊娠15 日の母体に拘束ストレスを3 日間加え、胎生18日および生後3週でGad1+/GFPヘテロ胎仔（Two-hit）脳のACh細胞に関連するLhx8, Isl1, Ngfr, ChAT, Lhx6, Slc18a3 mRNAの発現量を定量的にRT-PCRで同腹野生型と比較した。胎生18日Two-hitですべての発現が増加傾向にあったが有意差はつかず、生後3週ではすべて有意に増加した。
２．臨界期ストレス暴露大脳皮質錐体細胞の電気生理学的解析：生後3-8 週齢で、大脳皮質内側前頭前野（mPFC）スライス標本の錐体細胞からパッチクランプでトニックGABA抑制電流、自発性（sIPSC）、刺激誘発性（eIPSC）及び微小抑制性シナプス後電流（mIPSC）を記録した。抗コリンエステラーゼ（ドネペジル）は対照群(Gad1+/GFPヘテロ 無ストレス)でsIPSC の頻度と振幅を増加したがTwo-hitに無効であった。一方、ムスカリン性ACh受容体阻害薬（アトロピン）を加えると対照群とTwo-hitの差はなくなった。以上から、Two-hit ではACh入力が増しGABA作動性抑制性神経伝達が強化され、少なくとも一部はムスカリン性受容体の関与が示唆された。
３．臨界期ストレス暴露成体脳の免疫組織化学的解析：妊娠15 日の母体に細胞発生マーカーEdU を腹腔注射し、拘束ストレスを加えた。抗ChAT抗体、抗EdU抗体の2重染色で線条体や前脳基底部でのACh細胞の発生数を解析したが、同腹野生型と有意差はなかった。１．の結果と合わせACh細胞の分化が亢進し、mPFCへのAChの軸索投射が増加したと考えられた。
４．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質GABA 細胞の電気生理学的機能解析：生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本のGABA 細胞（GFPで同定）からパッチクランプ記録を行った。自発性興奮性シナプス後電流（sEPSC）に変化はなかった。一方で、電流‐発火関係解析では膜特性変化による興奮性上昇が明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GABA細胞からACh細胞への発生の転化（GABA細胞減少とACh細胞の増加）ではなく、ACh細胞の分化にシフトした結果、mPFCへのAChの軸索投射が増加したことを明らかにできたこと。さらに、錐体細胞でのGABAシナプス電流の強化は、GABA細胞へのグルタミン酸作動性興奮性入力が増えたことではなく、ACh入力が増加したことで、GABA細胞の興奮性が増したことが原因である可能性を示したことによる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．臨界期ストレス暴露大脳皮質錐体細胞の電気生理学的解析：昨年度に引き続き以下を行う。生後3-8 週齢で、大脳皮質内側前頭前野（mPFC）スライス標本を作製し錐体細胞からパッチクランプ記録を行う。抗コリンエステラーゼ（ドネペジル）、選択的ACh受容体阻害薬：アトロピン（ムスカリン性）、methyllycaconitine（MLA；ニコチン性α7）、dihydro-β-erythroidine（DhβE；ニコチン性α4β2）を投与し、抑制性電流の変化を対照群(Gad1+/GFPヘテロ 無ストレス)と比較する。強化されたGABA作動性抑制性神経伝達がAChによっておこることを証明し、関与する受容体サブタイプを同定する。
２．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質GABA 細胞の電気生理学的機能解析：昨年度に引き続き以下を行う。生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本を作製してGABA 細胞をGFP（knock-in）で同定し、パッチクランプ記録を行う。昨年度の結果で、膜興奮性の上昇として発火閾値の低下と発火頻度の上昇がみられたので、変化した電流を同定する。さらにドネペジルやACh受容体阻害薬の作用を確認して、AChによるGABA細胞の形質変化を証明する。
３．臨界期ストレス暴露成体大脳皮質の神経回路機能解析：大脳皮質カラム構造の形成に発達過程におけるACh作動性の皮質入力が関与する（Dupont, Nature 2006）。そこで、生後3-8 週齢でmPFC のスライス標本を作製し、膜電位光学測定法によるイメージングで白質の電気刺激で誘発された興奮伝播（特に側方拡散）を対照群と比較して、モデルにおける機能的カラム構成と神経回路機能の変化を解析する。コリンエステラーゼ及び抗コリンエステラーゼ、選択的ACh受容体阻害薬：アトロピン、MLA、DhβEを投与して興奮伝播観察による神経回路機能評価を行い、臨界期ストレス暴露によるACh入力の増加とその影響を明らかにする。あるいはin vivo 2光子によるCaイメージング法で、 ACh入力の影響を明らかにする。
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[Journal Article] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H+-ATPases is essential for brain development in humans and mice2021
Author(s)
Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 2107
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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