直鎖型ポリユビキチン鎖合成の構造的基盤の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: New aspect of the ubiquitin system : its enormous roles in protein regulation
• Project/Area Number: 25112514
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 杤尾 豪人 京都大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (70336593)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 構造解析 / ユビキチン / NMR / X線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

本課題では、直鎖型Ub鎖の合成に与るユビキチンリガーゼ、LUBAC（Linear UBiquitin chain Assembly Complex）のUb鎖伸長機構の解明を目指し、構造生物学的研究を行った。LUBACは、HOIL-1L、HOIP、SHARPINからなるが、このうち、HOIL-1LとHOIPからなる二者複合体でも直鎖型Ub鎖の伸長が行え、さらにはその一部領域（miniLUBAC）でも、直鎖Ub伸長活性があるので、まずはminiLUBACの解析を試みた。しかしながら、安定した試料を調製できたものの、結晶化には至っておらず、現在も検討中である。他方、LUBACのヘテロ三量体が形成される機構を解明するために、HOIPとSHARPINの複合体形成を調べた。両者が相互作用する部位からなる複合体を調製し結晶化を試みたところ、結晶が得られる条件を見出した。但し、X線結晶回折実験から得られたデータは、分解能７～８オングストロームと不十分であった。コンストラクトの再検討を進めている。

以上と平行して進めていた、オートファジー系に関わるユビキチン結合タンパク質であるNBR1のUBA(Ubiquitin association domain)の立体構造解析を完了した。NMR滴定実験から、当該UBAのユビキチン結合様式は典型的なUBAドメインと同様であることが分かった。また、このUBAが二量化することも見出した。但し、このUBA二量体は、p62 UBAの二量体ほど安定ではないことも分かった。さらに、ITC(Isothermal Titration Calorimetry)によってUBAとLys48ポリユビキチン鎖、Lys63ポリユビキチン鎖との結合実験を行った結果、何れの鎖にも同程度の親和性で結合することを明らかにした。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The unexpected role of polyubiquitin chains in the formation of fibrillar aggregates. (2015)
  • Author(s): Morimoto D, Walinda E, Fukada H, Sou YS, Kageyama S, Hoshino M, Fujii T, Tsuchiya H, Saeki Y, Arita K, Ariyoshi M, Tochio H, Iwai K, Namba K, Komatsu M, Tanaka K, Shirakawa M.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 6 Pages: 6116:1-10
  • DOI: 10.1038/ncomms7116
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The structural basis for receptor recognition of human interleukin-18. (2014)
  • Author(s): Tsutsumi N, Kimura T, Arita K, Ariyoshi M, *Ohnishi H, Yamamoto T, Zuo X, Maenaka K, Park EY, Kondo N, Shirakawa M, Tochio H, Kato Z.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 5 Pages: 5340:1-13
  • DOI: 10.1038/ncomms6340
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Solution structure of the ubiquitin-associated (UBA) domain of human autophagy receptor NBR1 and its interaction with ubiquitin and polyubiquitin. (2014)
  • Author(s): Walinda E, Morimoto D, Sugase K, Konuma T, Tochio H, Shirakawa M.
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 289 Pages: 13890-13902
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.555441
  • Peer Reviewed
• [Presentation] The structural basis for receptor recognition of interleukin-18 (2014)
  • Author(s): Hidehito Tochio
  • Organizer: International NMR Symposium on Pharmaceutical NMR
  • Place of Presentation: Osaka University
  • Year and Date: 2014-12-20 – 2014-12-20
  • Invited
• [Presentation] タンパク質NMRの生体系への応用：新規MRI及びin-cell NMR法 (2014)
  • Author(s): 杤尾 豪人
  • Organizer: 第53回NMR討論会
  • Place of Presentation: 大阪大学コンベンションセンター
  • Year and Date: 2014-11-04 – 2014-11-06
  • Invited
• [Presentation] Structural study of the recognition mode of interleukin-18 by the receptors. (2014)
  • Author(s): Hidehito Tochio
  • Organizer: Symposium on Structure and Folding of Disease Related Proteins
  • Place of Presentation: Seoul University
  • Year and Date: 2014-07-11 – 2014-07-11
  • Invited