多要素からなる人工代謝経路の構築

• Project Area: Synthetic biology for the comprehension of biomolecular networks
• Project/Area Number: 23119004
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 柘植 謙爾 Keio University, その他の研究科, 講師 (70399690)
• Project Fiscal Year: 2011-07-25 – 2016-03-31(Estimated)
• Project Status: Adopted(Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥83,460,000 (Direct Cost : ¥64,200,000、Indirect Cost : ¥19,260,000); Fiscal Year 2015 : ¥12,740,000 (Direct Cost : ¥9,800,000、Indirect Cost : ¥2,940,000); Fiscal Year 2014 : ¥14,560,000 (Direct Cost : ¥11,200,000、Indirect Cost : ¥3,360,000); Fiscal Year 2013 : ¥15,990,000 (Direct Cost : ¥12,300,000、Indirect Cost : ¥3,690,000); Fiscal Year 2012 : ¥19,110,000 (Direct Cost : ¥14,700,000、Indirect Cost : ¥4,410,000); Fiscal Year 2011 : ¥21,060,000 (Direct Cost : ¥16,200,000、Indirect Cost : ¥4,860,000)
• Keywords: ゲノムデザイン / 合成生物学 / 遺伝子発現制御 / 人工オペロン / 遺伝子集積 / バクテリア / 代謝経路 / 多要素 / 遺伝子発現 / OGAB法 / アントシアニン / カロテノイド

Outline of Annual Research Achievements

平成２６年度も引き続き、多要素が関与する代謝経路として色素性物質の「カロテノイド」、「アントシアニン」の２つの代謝経路を取り上げ、以下の研究を行った。

「カロテノイド」　グルコースからカロテノイドの一連の代謝経路に関わる遺伝子は約３０個程度存在するが、これらのうち「カロテノイド合成経路」遺伝子５個を除く、一次代謝経路遺伝子群を「解糖系」、「メバロン酸・非メバロン酸経路」、「アセチルCoA生産経路」と、代謝経路ごとに分割し、それぞれ大腸菌遺伝子を集積した人工オペロンについては平成２５年度までに構築している。平成２６年度は、これらのオペロンを、代謝経路ごとに真核生物である出芽酵母遺伝子を用いた人工オペロンに交換することを行った。その結果、「カロテノイド代謝経路」を除くすべての人工オペロンについて、酵母遺伝子に交換したオペロンの構築に成功した。これらを全て連結することで、グルコースからカロテノイドまでの一連の代謝経路の全てが大腸菌以外の外来の遺伝子からなる人工カロテノイドゲノムを構築し、これをゲノム中の「解糖系」、「非メバロン酸経路」、「アセチルCoA生産経路」の遺伝子を全て欠損した大腸菌に導入することに成功した。

「アントシアニン」　平成２５年度までに構築したF3H、 DFR、 LDOXの3酵素遺伝子を連結した「３遺伝子ペラルゴニジンオペロン」をプラスミドの形で有する大腸菌を、本オペロンに対して出発材料となるナリンゲニンを添加した培地での培養において、その培養の種類を検討した結果、培地の変更により元のLB培地に比較して60倍のペラルゴニジンの高生産を実現し、菌体ペレットをペラルゴニジンの蓄積により赤く着色することに成功した。

Current Status of Research Progress

Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「カロテノイド」　すべての代謝経路において大腸菌遺伝子による人工オペロンとともに、出芽酵母の遺伝子からなる酵母遺伝子オペロンを構築し、かつ、酵母遺伝子オペロンのみを連結した人工カロテノイドゲノムの構築に成功した点は、大きな進展である。しかしながら、本ゲノムの最大の特徴となるはずの、グルコースを唯一の炭素源とした培地で生育しカロテノイドを生産することについては、まだ実現できていない。これは、作成したオペロン内の外来遺伝子の発現量のチューンアップがまだ不十分のためだと考えている。しかしながら、研究代表者の開発した遺伝子集積法のOGAB法を用いることで、様々な配列の人工オペロンを構築することが可能であるので、これを用いることで最終年度中に遺伝子発現のチューンアップは可能であると考えている。

「アントシアニン」　ナリンゲニンを出発材料に、構築したペラルゴニジン人工オペロンにより、菌体ペレットの着色に成功した点は、大きな成果である。一方、このオペロンをチロシンからナリンゲニンまで生合成する「ナリンゲニンオペロン」の後につないだ全長7酵素遺伝子から構成される「７遺伝子ペラルゴニジンオペロン」でペラルゴニジンの生合成を試みたが、蓄積は確認できなかった。「７遺伝子ペラルゴニジンオペロン」を有する大腸菌は、中間代謝産物のナリンゲニンを培地中に加えても、前述の「３遺伝子ペラルゴニジンオペロン」程度にはペラルゴニジンを生産しなかったことから、ナリンゲニン以降の代謝に関わる酵素遺伝子は、より高発現が必要であることが判明した。最終年度中にこれらの問題点は十分に解消できるものと考えている。

Research Output

• [Journal Article] Manuscript title: Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments (2015)
  • Author(s): Kenji Tsuge, Yukari Sato, Yuka Kobayashi, Maiko Gondo, Masako Hasebe, Takashi Togashi, Masaru Tomita, and Mitsuhiro Itaya
  • Journal Title: Scientific Reports Volume : 未定 Pages : -
• [Journal Article] 長鎖DNAの合成と合成生物工学での活用 (2013)
  • Author(s): 板谷光泰、柘植謙爾
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume : 91 Pages : 319-321
• [Journal Article] Rearrangement of gene order in the phaCAB operon leads to effective production of ultra-high-molecular-weight poly[(R)-3-hydroxybutyrate] in genetically engineered Escherichia coli (2012)
  • Author(s): Hiroe, Ayaka
  • Journal Title: Appl.Environ Microbiol. Volume : 78 Pages : 3177-3184
  • DOI: 10.1128/AEM.07715-11
• [Presentation] ゲノムデザインに向けた人工オペロンの構築 (2015)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 2015年度農芸化学会大会
  • Place of Presentation: 岡山大学（岡山県岡山市）
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [Presentation] ゲノムデザインにおける合成生物学の現状 (2015)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: JBA「合成生物学セミナー」－最近の科学技術動向と合成生物学を取り巻く課題について－
  • Place of Presentation: 鉄鋼会館（東京都中央区）
  • Year and Date: 2015-03-05
• [Presentation] 大腸菌非メバロン酸経路の人工オペロン化 (2014)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 日本農芸化学会
  • Place of Presentation: 川崎市
  • Year and Date: 20140328-20140330
• [Presentation] An attempt to construct an artificial operon for nonmevalonate pathway (2014)
  • Author(s): Kenji Tsuge, Takashi Togashi, Masako Hasebe, Masaru Tomita, and Mitsuhiro Itaya
  • Organizer: 13th Asian Conference on Transcription
  • Place of Presentation: オーストラリアメルボルン
  • Year and Date: 20140219-20140221
• [Presentation] 人工オペロンによるボトムアップ型ゲノムデザイン戦略 (2014)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 産業技術総合研究所生産プロセス部門若手WGセミナー
  • Place of Presentation: 産業技術総合研究所（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2014-12-19
• [Presentation] 大腸菌一次代謝経路遺伝子群の人工オペロン化 (2014)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-11-26 – 2014-11-28
• [Presentation] 人工オペロン設計による植物特異的色素・アントシアニンン合成の試み (2014)
  • Author(s): 吉積毅、冨田勝、板谷光泰、柘植謙爾
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2014-11-26 – 2014-11-28
• [Presentation] OGAB法を用いたボトムアップ型ゲノムデザイン戦略 (2014)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 合成生物シンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸大学（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2014-11-26
• [Presentation] 一次代謝経路遺伝子群の人工オペロン化 (2014)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 2014年グラム陽性菌ゲノム機能会議
  • Place of Presentation: いこいの村庄内（山形県鶴岡市）
  • Year and Date: 2014-09-03 – 2014-09-05
• [Presentation] 植物特異的色素・アントシアニン合成経路の移植をモデルとした人工オペロン設計手法確立の試み (2014)
  • Author(s): 吉積毅、冨田勝、板谷光泰、柘植謙爾
  • Organizer: 2014年グラム陽性菌ゲノム機能会議
  • Place of Presentation: いこいの村庄内（山形県鶴岡市）
  • Year and Date: 2014-09-03 – 2014-09-05
• [Presentation] Design and Construction of an Artificial Nonmevalonate Operon of Escherichia coli (2014)
  • Author(s): Kenji Tsuge, Takashi Togashi, Masako Hasebe, Masaru Tomita, Mitsuhiro Itaya
  • Organizer: Metabolic Engineering X
  • Place of Presentation: バンクーバー（カナダ）
  • Year and Date: 2014-06-15 – 2014-06-18
• [Presentation] 人工非メバロン酸経路オペロン構築の試み (2013)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸市
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 人工オペロン設計手法の確立を目指して～植物特異的色素・アントシアニン合成経路の移植～ (2013)
  • Author(s): 吉積毅、冨田勝、板谷光泰、柘植謙爾
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸市
  • Year and Date: 20131203-20131206
• [Presentation] 一次代謝経路の人工オペロンの構築 (2013)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会6.0
  • Place of Presentation: 山形県鶴岡市
  • Year and Date: 20131113-20131114
• [Presentation] アントシアニン合成人工オペロン設計に向けた網羅的酵素反応 (2013)
  • Author(s): 吉積毅、冨田勝、板谷光泰、柘植謙爾
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会6.0
  • Place of Presentation: 山形県鶴岡市
  • Year and Date: 20131113-20131114
• [Presentation] Construction of metabolic pathways that are comprised of multi-genes by operon strategy (2013)
  • Author(s): Kenji Tsuge
  • Organizer: CBI学会
  • Place of Presentation: 東京都江東区
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] Toward the establishment of design rule for artificial operons; transplanting plant specific pigment anthocyanin biosynthetic pathway as a model (2013)
  • Author(s): Takeshi Yoshizumi, Masaru Tomita, Mitsuhiro Itaya, and Kenji Tsuge
  • Organizer: CBI学会
  • Place of Presentation: 東京都江東区
  • Year and Date: 20131028-20131030
• [Presentation] DESIGNING OF METABOLIC PATHWAY BY OPERON STRATEGY (2013)
  • Author(s): Kenji Tsuge
  • Organizer: for Innovative Biorefinery in Beijing 2013
  • Place of Presentation: 中国北京
  • Year and Date: 20131020-20131022
• [Presentation] 枯草菌ゲノム工学：OGAB法による人工オペロンの構築 (2013)
  • Author(s): 柘植謙爾、富樫貴、長谷部雅子、冨田勝、板谷光泰
  • Organizer: グラム陽性菌ゲノム機能会議
  • Place of Presentation: つくば市
  • Year and Date: 20130907-20130908
• [Presentation] 人工オペロン設計手法の確立を目指して～植物特異的色素・アントシアニン合成経路の移植～ (2013)
  • Author(s): 吉積毅、冨田勝、板谷光泰、柘植謙爾
  • Organizer: グラム陽性菌ゲノム機能会議
  • Place of Presentation: つくば市
  • Year and Date: 20130907-20130908
• [Presentation] ゲノムデザイン学:人工解糖系オペロンの転写・翻訳解析 (2012)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 日本農芸化学会2012年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学
  • Year and Date: 2012-03-24
• [Presentation] Genome construction technology and genome design (2012)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 14th A-IMBN Annual Conference
  • Place of Presentation: タイ王国・Thailand Science Park(招待講演)
  • Year and Date: 2012-03-01
• [Presentation] Genome designing biology : Construction of glycolytic pathway by artificial operon (2011)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2011-12-13
• [Presentation] Construction of glycolytic pathway by artificial operon (2011)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: UK-Japan Workshop on Microbial Systems Biology
  • Place of Presentation: 鶴岡市先端研究産業支援センター
  • Year and Date: 2011-10-28
• [Presentation] ゲノムデザイン学:人工オペロンによる解糖系構築の試み (2011)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 日本農芸化学会東北支部第12回若手の会
  • Place of Presentation: いこいの村庄内
  • Year and Date: 2011-10-07
• [Presentation] 人工オペロンによる代謝経路のデザイン (2011)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 第63回日本生物工学会大会
  • Place of Presentation: 東京農工大学
  • Year and Date: 2011-09-28
• [Presentation] 人工オペロンによる解糖系の構築 (2011)
  • Author(s): 柘植謙爾
  • Organizer: 平成23年度グラム陽性菌ゲノム機能会議
  • Place of Presentation: 福山大学
  • Year and Date: 2011-08-25
• [Presentation] Investigation of an artificial glycolytic operon toward bottom-up designing of a genome
  • Author(s): Kenji Tsuge, Kenji Nakahigashi, Takashi Togashi, Masako Hasebe, Yuki Takai, Miki Hasegawa, Yasuyuki Igarashi, Naoyuki Sugiyama, Naomi Sato, Yoshiaki Hirayama, Yasushi Ishihama, Tomoyoshi Soga, Masaru Tomita, and Mitsuhiro Itaya
  • Organizer: UK-Japan Workshop
  • Place of Presentation: 京都市
• [Book] Chapter 4 Efficient and Accurate Production of De Novo Designed Large-Size Gene Clusters by a Novel Bacillus subtilis-Based System (In, Microbial Production, (Eds) Hideharu Anazawa and Sakayu Shimizu) (2014)
  • Author(s): Mitsuhiro Itaya, Shinya Kaneko, and Kenji Tsuge
  • Total Pages: 18
  • Publisher: Springer
• [Book] Escherichia coli and Bacillus subtilis ; the frontiers of molecular microbiology revisited (2012)
  • Author(s): Itaya, Mitsuhiro
  • Publisher: Chapter 9 Genome integrity, instability and construction(掲載決定)
• [Remarks] 新学術領域研究動的・多要素な生体分子ネットワークを理解するための合成生物学の基盤研究
  • URL: http://www.syn-biol.com/
• [Remarks] 所属機関作成の研究内容の紹介
  • URL: http://www.iab.keio.ac.jp/jp/content/view/328/139/
• [Remarks] 新学術領域研究 動的・多要素な生体分子ネットワークを理解するための合成生物学の基盤研究
  • URL: http://www.syn-biol.com/
• [Remarks] 慶應義塾大学 先端生命科学研究所 柘植謙爾
  • URL: http://www.iab.keio.ac.jp/jp/content/view/328/140/
• [Remarks] 新学術領域研究 動的・他要素な生体分子ネットワークを理解するための合成生物学の基盤研究
  • URL: http://www.syn-biol.com/
• [Remarks] 慶應義塾大学 先端生命科学研究所 柘植謙爾
  • URL: http://www.iab.keio.ac.jp/jp/content/view/328/139/