有機合成化学を基盤とする非天然型有用生体機能物質の創製
Project/Area Number |
01J01419
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Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 国内 |
Research Field |
Organic chemistry
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Research Institution | The University of Tokyo (2003) Nagoya University (2001-2002) |
Principal Investigator |
早川 裕之 東京大学, 大学院・工学系研究科, 特別研究員(PD)
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Project Period (FY) |
2001 – 2003
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Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,900,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
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Keywords | RNAi / siRNA / boranophosphate / backbone modified DNA / exo-nuclease / nuclease resistant / enzymatic synthesis / RNA transcription template / 修飾型核酸 / 有機化学合成 / DNAデリバリー / RNAアンチセンス / 高分子ポリマー |
Research Abstract |
siRNAを用いるRNAi研究を行った。現在非常に注目を集めている哺乳動物の細胞内でsiRNAを発現させる場合、それらを発現する長い遺伝子を羅患部位に直接接種あるいは点滴等を用いて静注することが必須となる。ここで大きな問題となるのが導入する遺伝子(DNA)の生体内での安定性である。生体外部から導入された遺伝子の生体内での寿命は一般的に極めて短く、それらは導入後まもなく何の機能をも果たさなくなるほどの長さに細かく切断される。それは生体自身が持つ生体外物質に対する基本的防御機構によるものであり、その役割を直接的に果たすのがexo-およびendo-nucleaseである。そこで各種nucleaseに抵抗しうる鋳型DNAの調整法を確立した。まず天然型dATP、dCTP、dGTPおよびα-ボラノチミジン三リン酸存在下、PCR法を用いて任意のdsDNAを複製した。このdsDNA中に存在するすべてのチミジンの5'-側リン酸部位では、リン酸部位の水酸基が完全にホウ素に置換されている。また複製されたdsDNAの塩基配列はシーケンス解析によって確認した。得られたdsDNAにはT7RNAポリメラーゼプロモーターが存在するためT7RNAポリメラーゼを用いて転写試験を行ったところ、ボラノホスフェートDNAから初めてRNAが転写されたことが確認された。さらにプロモータ部位に存在するチミジンの5'-側リン酸部位は天然型リン酸型でもボラノホスフェート型でもいずれの場合でも問題なく転写は進行した。同様にすべてのヌクレオシド三リン酸をα-ボラノホスフェート三リン酸に置き換えてPCR法を用いてcircular DNAから任意の部位をdsDNAとして複製したところ、問題なくすべてのリン酸部位がホウ素化されたボラノホスフェートDNAを得ることができた。このようにして調整されたボラノホスフェートDNAを用いてRNAi実験を行ったところ、天然型DNAと同じようにRNAi活性を示すことが確認された。続いてボラノホスフェートDNAのexo-およびendo-nucleaseに対する耐性を検証したところ、exo-nucleaseに対して完全な耐性を示したもののendo-nucleaseに対しては天然型DNAのそれと同程度あるいはendo-nucleaseによっては天然型DNAよりも耐性がないことが確認された。この特異な性質は、DNA骨格にBH3が存在することによって生じたDNAの全体構造のひずみや、二本鎖DNA構造の不安定化が引き起こす部分的一本鎖構造の存在確率の上昇がendo-nuclease耐性を著しく下げているためだと考えられる。さらに研究を進めていった結果、同様の理由からヒト血清に対する耐性も著しく低いことが確認された。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)