| Project/Area Number |
04J00841
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Applied biochemistry
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高橋 圭 京都大学, 農学研究科・特別研究員 DC2
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| Project Period (FY) |
2004 – 2005
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2005)
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| Budget Amount *help |
¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
Fiscal Year 2005: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2004: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | ABCA1 / Sf9 / purification / ATPase / apoA-I / HDL / リン脂質 / コレステロール / Apolipoprotein A-I |
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| Research Abstract |
当研究員はこれまでに昆虫細胞Sf9にヒトABCA1を発現させ精製し、精製ABCA1のATP加水分解活性を人工リポソームに組み込むなど様々な条件下において測定することにより機能解析をおこなった。生化学的アプローチの結果から、ホスファチジルコリンとコレステロールがABCA1の輸送基質となるモデルを提唱した。
この研究の経緯から、ヒト膜タンパク質を精製しその機能をさらに詳細に解析するためには、哺乳類由来培養細胞を用いることが有利であると考え、胎児腎臓由来293F-FreeStyle細胞を用いてABCタンパク質を大量に発現させる系を構築した。293F-FreeStyle細胞で安定に発現させたABCA1はSf9を用いたときより高い効率で可溶化された。また、293F-FreeStyle細胞に安定発現させたABCA3は、肺胞II型細胞に発現した内在性ABCA3と同様にリソソームでプロセッシングを受け、高い効率で膜から可溶化された。続けて、ABCA3のプロセッシングによる成熟化についてより詳細に解析した。
ABCA3安定発現293F-FreeStyle細胞で非代謝型のグルコースを用いてオートファゴリソソームを誘導すると成熟型ABCA3が増加した。またリソソームのpH低下を解消する試薬であるクロロキンで処理すると成熟型ABCA3が顕著に低下した。さらに、ABCA3の発現によって細胞内のpHが有意に低下することが、蛍光顕微鏡を用いた解析によって明らかとなった。成熟型ABCA3は、前駆体ABCA3とともにヒスチジンタグと陰イオン交換カラムのDE52を用いて高収率で精製することができ、精製ABCA3は、ATP加水分解活性を示した。以上のことより、膜タンパク質の発現-精製系として293F-FreeStyleが有効であることが明らかとなった。現在ABCA1とABCA3の機能解析を精力的に進めている。
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