RecA非依存性新規組み換え系に関与する高度保存蛋白質Srpの機能解析

• Project/Area Number: 12780516
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Molecular biology
• Research Institution: Hokkaido Tokai University
• Principal Investigator: 海藤 晃弘 北海道東海大学, 工学部, 講師 (60251659)
• Project Period (FY): 2000 – 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2000: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
• Keywords: 大腸菌 / 組み換え / RecA非依存性 / 発現誘導 / 定常期 / DNA結合蛋白質 / λターミネース / 接合 / 遺伝的組み換え / 高度保存蛋白質

Research Abstract

Srp経路は染色体上のsrp領域が野生型の場合、srp領域にある3種のsrp遺伝子のいずれかをプラスミドにより供給する事によるRecA非依存性の組み換え現象として認められている。
1)Srp経路に対する個々のsrp遺伝子要求性の確認
3種のsrp遺伝子のSrp経路に対する寄与を評価するために、染色体上のsrp領域を全て欠失した変異株においてsrpプラスミドを用い、いずれかのsrp遺伝子が欠失した状態を再現し組み換え能を接合により判定した。その結果、Srp経路にsrpAとsrpC(hs10)遺伝子は必須である事が示された。
2)srp遺伝子発現誘導によるSrp経路活性化の検討
1)の菌株を用いた場合、srp遺伝子はいずれもlacのプロモーターにより支配された状態となる。Srp経路はIPTG30μM、また培養液が定常期初期に突入した時によく観察され、誘導時間が同一であっても培養液を対数増殖期に保った場合観察されなかった。このため定常期の因子を要求し、Srp蛋白質が多量にあっても効果がない事が分かった。
3)生体内でのSrp依存性組み換え反応の経時的測定
λターミネースによる生体内DNA切断系を用い、Srp経路によるDNA2重鎖切断修復を生存率により経時的に測定した。その結果、srpC遺伝子により生存率が維持される事が分かった。srp遺伝子誘導の効果を経時的に生存率とハイブリダイゼーションによる切断DNAの修復の両面から検討する。
4) Srp蛋白質群の生化学的機能解析
DNA結合蛋白質であるSrpB(Hs10)蛋白質を中心にSrp蛋白質群の機能解析を行った。その結果、SrpA蛋白質はSrpB蛋白質のDNA結合能を上昇させるかもしくはSrpB蛋白質と複合体を形成する事が分かった。効率良いSrp経路による組み換えは3つのSrp蛋白質が必要であるため、これらの蛋白質の混合による効果を検討している。