| Project/Area Number |
17H04981
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Neurophysiology / General neuroscience
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
山田 朋子 筑波大学, 医学医療系, 助教 (00447559)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Project Status |
Suspended (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2019: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2018: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2017: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000)
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| Keywords | ゲノム高次構造 / 学習と記憶 / 遺伝子発現 / 小脳 / ヒストンバリアント / 神経 / H2A.z |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私は主に核内の現象に着目して、小脳における学習と記憶のメカニズムを明らかにすること目指してきた。アメリカのワシントン大学のBonni研究室と共同研究を行い、小脳依存的な学習と記憶の行動実験時における核内の変化について研究してきた。そして彼らが新たに開発した小脳依存的な学習と記憶のパラダイムを用い、行動実験後にマウスの小脳組織を回収し、遺伝子発現やヒストン修飾やクロマチンの高次構造などのゲノム状態をシークエンス技術により解析した。
小脳は運動と感覚の統合を司る器官であり、歩行などの単純な行動によっても神経細胞が活性化される。そこでまず学習と記憶に関与する遺伝子群を、マウスの動きによって活性化される遺伝子群から分離することを考えた。そして統計的に似た挙動を示す遺伝子をグループ分けするWGCNAを用い、多くのRNA-seqのデータより、マウスの小脳における全ての遺伝子発現を２６グループに分類した。その結果、異なった行動によって異なった組み合わせのグループが活性化されることを見出した。そこで次にこれら学習や記憶によって活性化する遺伝子群に注目し、その制御機構を明らかにすることを試みた。
マウス個体において、歩行や記憶などの刺激は組織全体の数パーセント以下の神経細胞のみを活性化するので、活性化した神経細胞を集めて生化学的な解析をすることは難しい。そこで我々は光遺伝学を用いて人工的に神経細胞の脱分極を誘導し、遺伝子発現のメカニズムを明らかにすることにした。Bonni博士らは光遺伝学を用いて小脳のある特定の神経細胞を活性化することで、記憶を誘導できることを確認した。そこで私は特に光遺伝学によって脱分極が誘導された神経細胞群の生化学的な解析を行い、ヒストン修飾やゲノム高次構造の変化に関する知見を得た。そして小脳の学習と記憶における遺伝子発現の制御機構に関する知見をまとめ、論文として報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
成熟した神経細胞の遺伝子発現におけるエピジェネティック制御に関する知見は未だ限定的である。そこで私はまずゲノム上のヒストン修飾を網羅的に解析するためにクロマチン免疫沈降を行った。用いたのは光遺伝学によって人工的に神経細胞の脱分極を誘導した小脳サンプルであり、私は特に遺伝子発現の活性化に伴うヒストン修飾の局在を調べた。すると興味深いことに、遺伝子発現の誘導と遺伝子プロモーター上におけるアセチル化H3K27の修飾はほぼ相関関係にあり、また遺伝子発現の誘導とヒストン異性体H2A.zの局在は反相関関係にあった。これらの結果は、成熟した神経細胞において脱分極に伴う遺伝子発現の誘導が遺伝子制御領域のエピジェネティックな活性化を伴うことを示唆している。
次に私は、遺伝子発現の誘導に伴うゲノムの高次構造の変化に興味を持った。ゲノムは機能的に分画された比較的安定な高次構造をもつが、一過的な遺伝子の誘導発現とゲノム高次構造の関係はまだ明らかではない。私は光遺伝学によって活性化された細胞を用いてゲノムの高次構造の変化を調べるためにHiC法とPLAC-Seq法を行った。マウスの神経細胞において、脱分極による活性化はゲノムの高次構造、特に遺伝子制御領域エンハンサーとプロモーターの結合を誘導した。そしてその結合の強弱は遺伝子発現と相関関係にあった。もっと大きなスケールで見ると、活性化されているゲノム領域は、核内の転写活性化領域であるAコンパートメントへと誘導されることがわかった。そしてCohesinがこれらゲノム高次構造の制御、遺伝子発現、そして学習と記憶に重要な役割を果たすことを見出した。これらの発見は遺伝子発現誘導に伴うゲノム高次構造変化に関する新しい知見であり、非常に興味深い。またこれは成熟した神経細胞におけるゲノム高次構造についての全く新しい知見でもあり、神経科学分野においても重要な研究である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに見出した知見は論文として発表することができたが（Nature 2019, in press）、知覚刺激によってどのようなメカニズムでゲノム高次構造の再構成が起こるのかという疑問が残る。現在はその疑問を解き明かすことを目指している。これまでのES細胞などを用いた研究より、ゲノム高次構造の制御にはCohesin複合体やctcfが重要な役割を果たすことが報告されてきた。しかし神経細胞などの分化した、それ以上分裂しない細胞における知見はまだあまりない。そこで私は神経細胞におけるゲノム再構成の制御の解明を目指し、ゲノム高次構造に関わるタンパク質群に焦点を当てて研究を行っている。神経細胞を活性化すると、Cohesinのサブユニットの一つであるRad21のゲノム上における局在が変化したが、Ctcfの局在には変化がなかった。そしてこのRad21局在の変化は遺伝子発現の変化と相関関係にあった。つまり神経細胞が活性化されると、遺伝子発現を誘導するためにCohesin複合体がゲノム上の特定の場所にリクルートされてくるという可能性を示唆している。そこでCohesin複合体の他のいくつかのサブユニットやNibplなどについても同様のChIP-Seq実験を行い、ゲノム上における局在と神経細胞の活性化との関係を解析する。まずCohesin複合体やNibplの局在が変化したゲノム配列をバイオインフォマティクスによって解析し、それがどのような領域なのか調べ、また転写因子の結合についても解析する。またatac-Seqを行い、神経細胞の活性化前後における転写因子の結合分布の変化を調べる。これらの情報を統合し、どのような転写因子がゲノム高次構造に関わる因子をリクルートするのか仮説を立てる。そして得られた候補因子の解析を行う。
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