ニューロン自律的プロセスに着目したプリオン病神経変性メカニズムの解析
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18J12535
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Research Field |
Veterinary medical science
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| Research Institution | Hokkaido University |
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| Research Fellow |
田中 美咲 北海道大学, 大学院獣医学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2020-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2019: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2018: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | プリオン病 / 神経変性 / ニューロン / PrPSc / シナプス / UPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プリオン病では異常型プリオンタンパク質 (PrPSc) の産生に伴い、脳内でシナプス減少、神経細胞脱落といった神経変性徴候が認められるが、その具体的なメカニズムは明らかでない。本研究は特に神経細胞でのPrPSc産生が、グリア細胞などを介さずに直接惹起する神経変性徴候とそのメカニズム（ニューロン自律的プロセス）の解明を目的とするものである。
マウス大脳皮質及び視床由来の神経細胞初代培養を有糸分裂阻害剤で処理しグリア細胞を排除したうえで、プリオン感染による神経細胞の変化を解析したところ、synaptophysinをはじめとするシナプスタンパク質の減少を認めた。また視床由来の初代培養では、プリオン感染によりNeuN陽性神経細胞数が減少した。プリオン病マウスモデルを用いた先行研究では、小胞体ストレスに対するUnfolded Protein Response (UPR) による長期的な翻訳抑制が神経変性に寄与することが示されている。本研究においてもプリオン感染によりセンサー分子であるPERKがリン酸化される傾向にあり、PrPScが負荷となり神経細胞に小胞体ストレスがかかることが示唆された。一方でATF4など本機構の機能分子の翻訳・転写誘導は認められず、神経細胞とPrPScの直接的相互作用によるUPR活性化への寄与は限定的であることが明らかとなった。
プリオン感染に伴う神経細胞内分子動態の変化を包括的に理解するため、次世代シーケンサーを用いてプリオン非感染、感染神経細胞からトランスクリプトーム情報を取得し、全遺伝子について発現量を比較した。その結果、プリオン感染により特徴的な発現変動を示す遺伝子が大脳皮質由来神経細胞で5個、視床由来神経細胞で11個見つかった。現在、これらの遺伝子を中心にバイオインフォマティクス解析による機能予測に着手し、神経変性につながる分子経路の推定に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、神経突起密度及び細胞密度についてプリオン感染後の経時的データを取得した。プリオン感染神経細胞では神経密度は低下傾向にあり、特に視床神経細胞では感染後14日以降、神経細胞数が有意に減少することを明らかにした。そこで本研究ではプリオン感染後14及び21日目の神経細胞初代培養を重点的に解析に供することとした。
また本年度はUPR (PERK-eIF2α経路) の活性化状態の評価を進めた。小胞体ストレスが生じると、PERK及びeIF2αのリン酸化に続きATF4の翻訳誘導、CHOP等の転写誘導が起こる。しかし本研究は、プリオン感染神経細胞でリン酸化PERKは増加傾向にあるもののATF4及び下流因子は誘導されず、PrPScと神経細胞の直接相互作用による本経路の活性化が限定的であることを示した。
免疫染色によるシナプス密度の評価では、神経突起末端部まで可視化するためGFP導入法を検討した。当初計画していたリポフェクション及びレンチウイルスベクターによる導入は細胞毒性及び導入効率の点で問題があり、次策としてアデノ随伴ウイルスベクターとシナプシンプロモーターを用いることで実現した。現在synaptophysin及びPSD95を免疫染色してGFP陽性の神経細胞体・神経突起とともに可視化し、PrPScのシナプス密度への影響評価を実施している。
神経細胞のトランスクリプトーム解析については、次世代シーケンサーで計24サンプル (N=3) のRNA-Seq情報を取得完了した。マウスのprotein coding gene のうちプリオン感染により、感染後14, 21日の2 時点で有意な発現変動を示す遺伝子を大脳皮質神経細胞で5個、視床神経細胞で11個同定した。現在、バイオインフォマティクスによりプリオン感染による遺伝子発現変動がもたらす生物学的機能変化の解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
プリオン感染神経細胞ではシナプスがタンパク質量として減少するが、シナプスの構造として密度の低下を伴うかを明らかにするため、前後シナプス終末マーカーを免疫染色し、シナプスの形態分析を進めている。
これまでのイムノブロット及びRT-PCRによる分析には神経細胞のクルードサンプルを供しており、シナプスタンパク質の減少は検出された一方でUPR活性化の徴候は極めて限定的であった。しかし実際には、本研究で用いている初代培養神経細胞が形態的に異なる特徴をもつ神経細胞サブタイプの混在した集団であることが明らかとなっており、PrPSc産生量も細胞によって多寡が認められる。そこで、蛍光抗体法によりPrPScとシナプスタンパク質、UPRマーカー分子の二重染色を実施し個々の神経細胞についてPrPSc保持量とシナプス数及びUPR活性化状態の同時評価を進めている。これにより、PrPSc産生量と細胞応答・障害の相関を明らかにできると同時に、プリオンに脆弱な神経細胞サブタイプが見つかる可能性がある。
またトランスクリプトーム解析でプリオン感染により発現が変動する16遺伝子について、強制発現もしくはノックダウン下でNeuN陽性細胞数を計測し、神経変性への寄与を明らかにする。強制発現はシナプスの形態解析に用いているアデノ随伴ウイルスベクターに遺伝子をクローニングして行い、ノックダウンはsiRNAを使用する。また当研究室で取得したプリオン感染マウスの視床組織トランスクリプトームと本研究のデータを比較することで、神経細胞特異的な（ニューロン自律プロセスによる）変化と、グリア細胞などの干渉を受けて生じる変化を推定することができる。これにより神経細胞とグリア細胞それぞれの、プリオン病神経変性メカニズムに対する寄与を明らかにできれば、病態発現・進行の真の責任因子の同定と、最大の効果をもつ治療薬の開発に貢献できる。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
