自然免疫受容体ＮＬＲＰのインフラマソーム活性化機構の構造科学的解明

• Project/Area Number: 18J22916
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Research Fellow: 村上 果林 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2020: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2019: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2018: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: タンパク質三次元構造解析 / 自然免疫 / 糖鎖認識機構 / X線結晶構造解析 / 自然免疫受容体 / NLRP3

Outline of Annual Research Achievements

（自然免疫タンパク質NLRP3の構造解析について）　昨年度までは複数の哺乳動物由来のNLRP3の結晶化に主に取り組んでいたが、Sharif H, Wang Lらによってクライオ電子顕微鏡にてヒトNLRP3の全長の三次元構造が解かれた(Nature. 2019)ことにより従来の研究計画を継続することが難しくなったため、今後は、以前から並行して進めていた自然免疫関連タンパク質Cochlinの構造解明及び機能解析に注力することとした。

（マウス由来のCochlinの発現系、精製系構築）　ヒト及びマウス由来のCochlinの発現ベクターを複数種類作製し、哺乳細胞または昆虫細胞を宿主とした安定発現系を構築した。各発現系における発現量の比較を行った結果、マウスCochlinの昆虫細胞発現系において最も発現良好であることを見出し、精製条件・結晶化条件検討に必要な十分量のタンパク質粗精製試料の調製を達成した。続いて精製条件の検討やタグ切断条件の検討を行い、1L培養液あたり数mgの単量体試料を得ることができた。

（Cochlinのリガンド糖構造同定に向けた相互作用解析）　ヒトまたはマウスCochlinのリコンビナントタンパク質を用い、リガンド同定に向けた相互作用解析を行った。エバネッセント波励起型蛍光検出法による糖鎖アレイ解析により、ヒト及びマウスCochlinはいずれも、硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)の一つであるヘパリンに特異的に結合することを見出した。さらに、化学合成されたGAG二糖単位のアレイを用いた表面プラズモン共鳴を実施し、親和性の高いヘパリンの二糖ユニットの特徴を明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

Sharif H, Wang Lらによってクライオ電子顕微鏡にてヒトNLRP3の全長の三次元構造が解かれた(Nature. 2019)ことにより申請当初の研究計画を継続することが難しくなったため、今後は、以前から並行して進めていた自然免疫関連タンパク質Cochlinの構造解明及び機能解析に注力することとした。
Cochlinについて現在までにmgスケールの発現系の構築を達成したことや、リガンド未知であったCochlinについてリガンド糖構造を解明したことから、Cochlinの単量体の結晶化並びにリガンドとの共結晶化に向けて順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

Cochlin単量体の結晶構造解析に向けて、今後、昆虫細胞発現系にて得られるマウスCochlinの純度向上のため、さらに精製条件の検討を進めるとともに、結晶化条件の検討を行う。
また、Cochlinとリガンド糖構造との共結晶化に向けて、今後、定量的な親和性測定を進めるとともに、結晶化条件の検討を行う。