シナプス間隙コンパートメントの構築機構と機能

Research Project

Project/Area Number	18K06471
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
Research Institution	Kyoto Sangyo University
Principal Investigator	浜千尋京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (50238052)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2018)
Budget Amount *help	¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2018: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Keywords	シナプス / シナプス間隙 / アセチルコリン受容体 / ショウジョウバエ / サプレッサー変異 / Hig / Hasp
Outline of Annual Research Achievements	中枢シナプスにおけるアセチルコリン受容体（nAChR）は脳機能の形成に深く関わり、様々な脳疾患にも関与している。したがって、nAChRの局在量の制御機構の解明は、神経科学の分野で重要な問題であるが、未だ明らかにされていないのが現状である。われわれは、今までにショウジョウバエをモデルとしてコリン作動性シナプスのシナプス間隙に特異的に局在するHigとHaspの２種の分泌性タンパク質を同定してきた。このうち、HigがnAChRの局在量を制御していることを明らかにしてきたが、本研究では、その制御メカニズムをさらに解明することを一つの目的とした。 Higと相互作用する分子を同定する目的で、hig変異のサプレッサー変異の分離を試みたところ、独立に２種の変異を分離することに成功した。塩基配列の決定により、これらの変異はnAChRサブユニットのDa5をコードする遺伝子中の異なるアミノ酸置換変異であることが判明した。また、Da5のnull変異をCRSPR/Cas9法により分離しhig変異との２重変異を作成したところ、Da5変異がhig変異をサプレッスすることがわかった。これらの結果から、Da5をコードする遺伝子がhig遺伝子のサプレッサーとして機能すると結論した。また、Higタンパク質が存在しない条件では、Da5は個体の生存に対して害を与えることも明らかとなった。それでは、Da5が欠損すると、何故hig変異の表現型がレスキューされるのだろうか。hig変異体では、Da5、Da6、Da7サブユニットのシナプス局在量がいずれも半分程度に減少するが、hig Da5二重変異体では、Da6のシナプス局在量が野生型並みに回復することが判明した。これらの結果から、Da5サブユニットはnAChRの局在量を抑制する機能をもち、その抑制をHigが抑えていると結論した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason アセチルコリン受容体（nAChR）の局在量制御機構の解明については新たな展開をむかえて研究は着実に進行している。その中で、特定のサブユニットがシナプス間隙のHigと相互作用しながらnAChRの局在を抑制的に制御するという新たな知見を得ることができた。また、その機構を解明するためのモデルの作成に至っており今後の研究の方向性はつけられている。一方で、シナプス間隙コンパートメントの形成機構については、Haspの局在を制御する新規膜タンパク質の同定に成功してはいるが、数種類の抗原配列を用いた抗体作成がことごとく成功しておらず、新規膜タンパク質の脳内における発現部位やシナプス内の局在についての情報を取得することができていない。そのため、コリン作動性シナプスに存在する複数のタンパク質の間に見られる相対的位置関係を高解像顕微鏡を用いて解明することが叶わない状況にある。このタンパク質の他にも、RNAi法を用いた発現抑制によるライブラリースクリーニングからHigやHaspの局在量を制御する膜タンパク質などの候補をいくつか同定してきているが、それらを詳細に解析するまでには至っていない。いずれのプロジェクトも重要な問題を含むため、さらに継続して進めていく予定である。
Strategy for Future Research Activity	アセチルコリン受容体（nAChR）の局在を抑制的に制御するDa5サブユニットの機能と性質をさらに明らかにするため、生化学的にHigとの複合体形成の有無を免疫沈降実験により確認する。また、nAChRサブユニットを細胞外ドメインとそれに続く膜貫通ドメイン等のC端側のドメインとに分けて、Da6およびDa7との間でドメインスワッピング実験を行い、各サブユニットのドメインと機能との関係性を解明する。さらに、Da5によるnAChRの局在抑制がエンドサイトーシスによって引き起こされるという仮説を立て、その検証のための実験を進める。具体的には、エンドサイトーシスを制御するdynaminの温度感受性変異shi[ts]を発現させ、許容温度を超えた温度でのサブユニットの局在量をサブユニットに対する抗体染色により調べる、あるいは蛍光標識されたa-bungarotoxinを摘出した脳のnAChRに結合させて蛍光強度の時間変化を調べ、その時間変化におけるshi[ts]の効果を解析する。これらの解析を野生型、Da5変異体、Da6変異体、hig変異体、hig Da5変異体などを用いて行い、Da5がエンドサイトーシスを通してnAChRの局在量を制御していることについての証拠を得る。 Haspの局在を制御する新規タンパク質に対する抗体作成については、抗原となり得る予測配列に対してほぼ全て抗体作成を試みて成功していないことから、免疫する動物種を変えて抗体作成を試みることを計画している。