第4世代ビスホスホン酸によるγδ型T細胞の新規活性化機序を応用した癌免疫療法開発

• Project/Area Number: 18K07274
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 小林 博人 東京女子医科大学, 医学部, 准教授 (80318047)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2018)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2018: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
• Keywords: ガンマ・デルタ型T細胞 / 癌性腹水 / 第４世代ビスホスホン酸 / 癌免疫細胞療法 / ガンマデルタ型T細胞 / 癌性腹膜炎 / 腹水濾過濃縮 / 第4世代ビスホスホン酸

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、癌性腹膜炎による難治性腹水に対し、新たな治療戦略として腹水中のγδ型T細胞を用いた癌免疫細胞療法を開発することである。癌性腹膜炎の症状緩和には、腹水を穿刺採取し、中空糸濾過カラムを通して癌細胞を含む細胞成分を除去後、濃縮して体に有用な蛋白を回収して、患者に静脈投与する腹水濾過濃縮再静注法（Cell-free Ascites Reinfusion Therapy: CART）が有用である。本研究では濾過カラムに残存し、本来は破棄される細胞成分を用いることが特徴である。まず、本研究を実施する上で必要な臨床研究実施計画書を作成し、東京女子医科大学倫理委員会へ実施承認の申請をした。研究課題名「腹水由来γδ型T細胞を用いた新規がん免疫細胞療法の開発」は、6月8日に承認された（承認番号3784-R2）。本年度は、4症例（卵巣癌患者3例、消化器癌１例）に同意取得後、計5回のCARTを施行し、腹水濾過カラムより細胞成分を回収し、研究に供した。まずγδ型T細胞の特異的活性化剤として、ピロリン酸系（2M3B1PP）、ビスホスホン酸系（ゾレドロン酸、新規活性化剤D9）を比較した。また、増殖因子としてインターロイキン2および18を添加して比較した。同一症例でも病状により腹水に含まれる癌細胞数に差があり、培養前単核球数を一定にすると、含有癌細胞の多寡によりγδ型T細胞数の増殖率に影響を与えることがわかった。そこで培養前混入癌細胞数の制御方法を検討した。癌性腹水中の癌細胞は細胞凝集塊または、単一細胞として存在している。細胞凝集塊をナイロンフィルターで取り除き、さらに残存癌細胞はナイロンウールカラムで取り除くことで、増殖率の改善になった。γδ型T細胞を培養する上で癌細胞は抗原提示細胞として働くが、活性化されたγδ型T細胞の標的細胞となるため、培養途中でほぼ完全に排除されることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究を開始する上で、研究者の所属する東京女子医科大学倫理委員会の承認が必須である。また、試料提供のため当該診療科の協力も不可欠である。研究実施計画書作成段階において、化学療法・緩和ケア科と産婦人科の医師から研究協力者の承諾を得ることができた。また研究実施計画書等を東京女子医科大学倫理委員会へ速やかに申請し、承認を得ることができた。研究試料は、当院化学療法・緩和ケア科と産婦人科より得られることになっているが、CARTの適応については、各診療科の判断となるため、定期的に得られないことが研究を進める上での制限となっている。また、培養条件を決める上でも得られた細胞数に制限があり、また同一患者であっても病状により腹水の状態が異なる事も、実験結果の再現を困難にしている。しかし同一患者でも、混入癌細胞数が少ない方が培養効率が良いことは明らかであった。混入癌細胞数が多い場合でも、最終的に混入する癌細胞は培養過程で除去されるため、培養前に完全に除去する必要は無く、培養前に減らすことで培養効率の向上が可能となった。また、増殖因子としてインターロイキン2および18を加えた方が増殖が良好であった。活性化したγδ型T細胞は、活性化抑制分子としてPD-1やCTLA-4を発現することが知られており、本研究でも培養の段階で抗PD-1抗体や抗CTLA-4抗体を添加して培養する予備実験も開始している。本年度の成果として、培養前癌細胞数制御の方法を見出し、単核球数を統一する培養条件の決定ができたことから、効率的に研究が進められると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

培養条件の検討では、同一症例の同一腹水において、混入癌細胞が10%以下に制御した場合、γδ型T細胞の活性化剤として新規化合物D9、増殖因子としてIL-2とIL-18、活性化抑制分子阻害として抗CTLA-4抗体を用いた場合が最もγδ型T細胞の増殖率と純度が良い傾向にあることを見出している。しかし、培養結果の再現性がまだ安定していない点が問題である。また、もともと腹水中に癌細胞が少ない症例の場合は、癌細胞の除去過程は不要であり、同一患者であっても、病状の進行により腹水の状態が異なると癌細胞除去という培養前処置が必要になってしまい、培養条件の比較検討が困難という問題が生じる。CART後に腹水細胞を回収した段階で、前処置の必要性を判断し、癌細胞の除去群と非除去群とに分けて比較検討することとした。また、本院のみで症例が不足する場合は、CARTを日常的に行なっている関連病院へも研究参加を依頼することも検討する。培養条件の最適化が成された後は、培養したγδ型T細胞の機能解析を行う。機能解析としては、将来的に培養した細胞を患者腹腔へ投与する臨床研究の実施を考えており、癌細胞に対する細胞障害試験の方法を樹立する必要がある。今までに51Crを用いた細胞傷害試験を行っていたが、本学総合研究施設では放射線同位元素が使用できる施設の閉鎖が決まっており、新たな測定方法の確立が必要である。現在CD107aの細胞表面への表出（脱顆粒）を指標とする方法の予備実験を開始している。