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Biosynthesis of chiral polymer with stereochmical reversion

Research Project

Project/Area Number 19K22069
Research Category

Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section Medium-sized Section 26:Materials engineering and related fields
Research InstitutionTokyo University of Agriculture

Principal Investigator

田口 精一  東京農業大学, 生命科学部, 教授 (70216828)

Project Period (FY) 2019-06-28 – 2022-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
Keywordsバイオポリマー / 重合酵素 / 立体化学 / キラリティー / 基質特異性 / 微生物重合 / ポリマー
Outline of Research at the Start

化学重合研究において、光学活性モノマーの立体化学を精密制御できる触媒を開発し光学純度の高いポリマーを合成することは、基礎・応用の両面において重要な課題である。一方、微生物産生ポリマーであるP(3HB)は、(R)体モノマーからなる超高光学純度ポリマーであり、細胞システム(関連酵素群の厳密な立体認識選択性)の特質が生かされている。「本来(R)体モノマーにしか反応選択性を示さない重合酵素を、(S)体モノマーを認識しポリマー鎖内に取り込めるように人工的に改変できないか?」というのが、本研究の中心課題である。この研究を通じて得られることは、重合酵素の基質認識を立体化学の視点から明らかにできることにある。

Outline of Annual Research Achievements

多様な微生物が細胞内に合成蓄積するポリヒドロキシアルカン酸(PHA)は、熱可塑性の脂肪族ポリマーとして利用されるカーボンニュートラルな資源循環環境材料として期待されている。材料特性を考える上で、光学純度は極めて重要な性質であることは周知である。PHAを構成する160種以上の天然モノマーユニットは、全て「R体」であり、光学純度の極めて高いキラルポリマーであることが特徴である。最も典型的なPHAポリマーであるP(3HB)は、3-hydroxybutyrate(3HB)のホモポリマーで、(R)-3HB-CoA(補酵素A)モノマーを前駆体として、重合酵素の触媒作用により重合され、100%eeのR体から構成される。
今年度は、ポリマー非生産菌である大腸菌において、S体の3HB-CoAを合成できる生合系の条件最適化を進捗させた。混合ラセミ体の3HB・Naを細胞外から添加し、3HB→3HB-CoAの合成反応を触媒する嫌気性細菌由来プロピオニルCoA転移酵素(PCT)を大腸菌に遺伝子導入した。アセチル-CoAをCoAドナー、添加3HBをアクセプターとした生合成を、P(3HB)のホモポリマー合成の可否によって判断した。重合酵素としては、(R)-3HB-CoAモノマーに反応性の高い水素細菌由来由来のものを使用した。こうして、3HB・Naのラセミ体の外部添加、PCT遺伝子導入、水素細菌由来重合酵素遺伝子の導入、の3つの条件を有する微生物培養系を構築できた。最適条件としては、終濃度2%グルコースを含有するLB培地にて30℃/48時間培養が安定的に作動した。PCTを組換え発現させたサンプルを用いて作製した抗体はインビボで使用可能できることも確認できた。(S)体の3HB-CoAは、(R)体の3HB-CoAと同様に定法に従って化学合成した。機能的に発現させたPCT組換えタンパク質を使用して、両鏡像異性体のモノマー基質に対して相対的反応性比を評価したところ、(R)体の3HB-CoAに対して高い反応性を示したが、微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対しても反応性を示すことが判明した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初より想定していた本挑戦的課題の完遂には、5点(ここの判断の基準欄と今後の研究推進方策欄で記述)のチェックポイントがある。昨年度の検討で(1)(R)体の3HBホモポリマーが合成できたことから、少なくと添加したラセミ混合物のうち(R)体の3HBが膜透過し、PCTの触媒作用を介して重合系に組み込まれたことが実証できたことになる。この段階で、(S)体の3HB・Naも同様に膜透過できる可能性が強く示唆された。モノマー前駆体である(S)体の3HB-CoAが、細胞内でPCTのCoA転移反応により3HB・Naから変換される必要がある。今回、その培養系の最適化に加え、(2)作製した抗PCT抗体によるインビボでの利用性も確認できた。その結果、使用した組換え大腸菌株において再現性良く発現が確認できた。次いで、インビトロでのPCTの3HB-CoAの鏡像異性体に対する反応性の評価をモノマー基質の化学合成品を用いて行った。その結果、組換えPCTが微弱ながら(S)体の3HB-CoAに対して反応性を示したことは極めて重要な知見である。すなわち、本酵素の立体化学認識に関して緩慢な性質を有することが、(S)型の3HBポリマーを合成する上での必須の要件であるからである。本来予定していたマイルストーンはクリアし、コロナ禍の状況下とはいえ、重要視していたチェックポイントの確認ができたことから順調に進捗していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

先に述べた、本挑戦的課題を突破するための5点(ここの判断の基準欄と今後の研究計画欄で記述)について検証する。今年度までにクリアした課題(1)~(3)の成果を受けて、後続の課題は以下のように説明される。(3)化学合成した立体化学反転(S)体の3HB-CoAに対する反応性、さらには(R)体の3HB-CoAとの相対的反応性比を評価することができたことから、今後必要な実験として、細胞内で合成される(S)体の3HB-CoAのプール量を測定することである。LC-MSを使用した、CoA体の化合物を細胞からの抽出物を対象として行うことである。本実験は、他機関との共同研究で行う予定である。通常、CoA体が細胞内チオラーゼ活性により分解を受けやすいので、安定的にアッセイできる分析系を立ち上げる必要がある。それ以降の、(4)(S)体の3HB-CoAに対して重合活性を獲得した重合酵素の進化分子工学用のスクリーニング系の確立(進化工学プログラムの構築)と(5)微生物合成できた(S)体の3HBがポリマー鎖への取り込みの確認とポリマーの分析、はパラレルに進行する予定である。ポイントは、完全なる反転ポリマー重合に至らなくとも、(S)-3HBモノマーの取り込み現象を感度良くキャッチすることである。

Report

(2 results)
  • 2020 Research-status Report
  • 2019 Research-status Report

Research Products

(28 results)

All 2021 2020 2019

All Journal Article (12 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 12 results,  Open Access: 10 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 8 results) Book (8 results)

  • [Journal Article] Microbial oversecretion of (R)-3-hydroxybutyrate oligomer with diethylene glycol terminal as a macromonomer for polyurethane synthesis2021

    • Author(s)
      Hiroe Ayaka、Sakurai Tetsuo、Mizuno Shoji、Miyahara Yuki、Goto Saki、Yamada Mariko、Tsuge Takeharu、Taguchi Seiichi
    • Journal Title

      International Journal of Biological Macromolecules

      Volume: 167 Pages: 1290-1296

    • DOI

      10.1016/j.ijbiomac.2020.11.083

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Microbial Production of Biodegradable Lactate-Based Polymers and Oligomeric Building Blocks From Renewable and Waste Resources2021

    • Author(s)
      Nduko John Masani、Taguchi Seiichi
    • Journal Title

      Frontiers in Bioengineering and Biotechnology

      Volume: 8 Pages: 1-18

    • DOI

      10.3389/fbioe.2020.618077

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Superior thermal stability and fast crystallization behavior of a novel, biodegradable α-methylated bacterial polyester2021

    • Author(s)
      Furutate Sho、Kamoi Junichi、Nomura Christopher T.、Taguchi Seiichi、Abe Hideki、Tsuge Takeharu
    • Journal Title

      NPG Asia Materials

      Volume: 13 Pages: 11-31

    • DOI

      10.1038/s41427-021-00296-x

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Effect of introducing a disulfide bridge on the thermostability of microbial transglutaminase from Streptomyces mobaraensis2021

    • Author(s)
      Yokoyama Keiichi、Ogaya Daisuke、Utsumi Hiroe、Suzuki Mototaka、Kashiwagi Tatsuki、Suzuki Eiichiro、Taguchi Seiichi
    • Journal Title

      Applied Microbiology and Biotechnology

      Volume: 105 Pages: 2737-2745

    • DOI

      10.1007/s00253-021-11200-6

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] The influence of medium composition on the microbial secretory production of hydroxyalkanoate oligomers2021

    • Author(s)
      Mizuno Shoji、Sakurai Tetsuo、Nabasama Mikito、Kawakami Kyouhei、Hiroe Ayaka、Taguchi Seiichi、Tsuge Takeharu
    • Journal Title

      J. Gen. Appl. Microbiol.

      Volume: 67 Issue: 4 Pages: 134-141

    • DOI

      10.2323/jgam.2020.09.002

    • NAID

      130008106876

    • ISSN
      0022-1260, 1349-8037
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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Microbial Polyhydroxyalkanoates (PHAs): From Synthetic Biology to Industrialization2020

    • Author(s)
      Miyahara Yuki、Hiroe Ayaka、Sato Shunsuke、Tsuge Takeharu、Taguchi Seiichi
    • Journal Title

      Biotechnology Journal

      Volume: 14 Pages: 231-264

    • DOI

      10.1002/9783527818310.ch8

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Bioconversion of biphenyl to a polyhydroxyalkanoate copolymer by Alcaligenes denitrificans A412020

    • Author(s)
      Yajima Taito、Nagatomo Mizuki、Wakabayashi Aiko、Sato Michio、Taguchi Seiichi、Maeda Michihisa
    • Journal Title

      AMB Express

      Volume: 10 Pages: 155-163

    • DOI

      10.1186/s13568-020-01093-5

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Isolation of poly[d-lactate (LA)-co-3-hydroxybutyrate)]-degrading bacteria from soil and characterization of d-LA homo-oligomer degradation by the isolated strains2020

    • Author(s)
      Chiaki Hori, Tomohiro Sugiyama, Kodai Watanabe, Jian Sun,Yuu Kamada Toshihiko Ooi, Takuya Isono,Toshifumi Satoh, Shin-ichiro Sato, Seiichi Taguchi, Ken'ichiro Matsumoto
    • Journal Title

      Polymer Degradation and Stability

      Volume: 179 Pages: 109231-109231

    • DOI

      10.1016/j.polymdegradstab.2020.109231

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Changed bacterial community in the river water samples upon introduction of biodegradable poly(3-hydroxybutyrate)2020

    • Author(s)
      Kadoya R, Tanaka N, Fujita N, Shiwa Y, Taguchi S
    • Journal Title

      Polymer Degradation and Stability

      Volume: 176 Pages: 109144-109144

    • DOI

      10.1016/j.polymdegradstab.2020.109144

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      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Microbial secretion platform for 3-hydroxubutyrate oligomer and its end-capped forms using chain transfer reaction-mediated polyhydroxyalkanoate synthases2019

    • Author(s)
      Y. Miyahara, A. Hiroe, T. Tsuge, S. Taguchi
    • Journal Title

      Biotechnol. J.

      Volume: 14 Pages: 321-328

    • DOI

      10.1002/biot.201900201

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      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxidase (RuBisCO)-mediated de novo synthesis of glycolate-based polyhydroxyalkanoate in Escherichia coli.2019

    • Author(s)
      Matsumoto K, Saito J, Yokoo T, Hori C, Nagata A, Kudoh Y, Ooi T, Taguchi S.
    • Journal Title

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      Volume: 印刷中 Issue: 3 Pages: 302-306

    • DOI

      10.1016/j.jbiosc.2019.03.002

    • ISSN
      1389-1723
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      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Microbial Production and Properties of LA-based Polymers and Oligomers from Renewable Feedstock2019

    • Author(s)
      Nduko John Masani、Taguchi Seiichi
    • Journal Title

      Part of the Biofuels and Biorefineries book series (BIOBIO, volume 9)

      Volume: 9 Pages: 361-390

    • DOI

      10.1007/978-981-13-3768-0_12

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      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 天然ポリマーから創発した多元ポリ乳酸LAHB2020

    • Author(s)
      田口精一
    • Organizer
      (公益社団法人)日本化学会 第10回CSJ化学フェスタ(2020)招待講演
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    • Invited
  • [Presentation] バイオプラスチックの生合成と生分解:多元ポリ乳酸研究の進展と関連分野の動向2020

    • Author(s)
      田口精一
    • Organizer
      (公益社団法人)新化学技術推進協会 ライフサイエンス技術部会・反応分科会
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    • Invited
  • [Presentation] Bio-oligomer provides insights into secretion and mechanistic biodegradation of lactate-based polymers2019

    • Author(s)
      S. Taguchi
    • Organizer
      The 7th International Conference on Bio-based Polymers
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Synthetic biology for biocompatible and biodegradable polymers from renewable biomass2019

    • Author(s)
      S. Taguchi
    • Organizer
      The 3rd International Biotechnology Congress (IBC-2019)
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Biocompatible and biodegradable PLA-copolymers biosynthesized by microbial platform from renewable feedstock2019

    • Author(s)
      S. Taguchi
    • Organizer
      10th International Conference on Biopolymers and Bioplastics
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      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 海洋分解など地球環境に貢献するバイオプラスチック、テーマ:海のゴミと食品ロス削減~命を思いやる想像力を育てる~(海と日本2019)2019

    • Author(s)
      田口精一
    • Organizer
      日本海老協会
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    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] バイオプラスチックの合成生物学=生合成×高分子化学2019

    • Author(s)
      田口精一
    • Organizer
      (公益社団法人)新化学技術推進協会のライフサイエンス技術部会・反応分科会・技術セミナー、(公益社団法人)新化学技術推進協会)
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    • Invited
  • [Presentation] 多元ポリ乳酸;基礎物性・機能部材化・生分解性12316;、テーマ<<海洋プラスチック問題解決に向けた>>生分解、バイオマスプラスチックの材料設計、将来展望2019

    • Author(s)
      田口精一
    • Organizer
      (株)技術情報協会
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    • Invited
  • [Book] バイオリアクターのスケールアップと物質生産事例集 乳酸ポリマーP(LAHB)の微生物生産2021

    • Author(s)
      田口精一
    • Total Pages
      12
    • Publisher
      技術情報協会
    • ISBN
      9784861048302
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  • [Book] 生分解性プラスチックの環境配慮設計指針 多元ポリ乳酸の合成/分解の交差点:「オリゴマー」2020

    • Author(s)
      田口精一
    • Total Pages
      11
    • Publisher
      シーエムシー出版
    • ISBN
      9784781314877
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  • [Book] 化学と生物 セミナー室 多元ポリ乳酸」の生合成と生分解:メカニズム解明の鍵"オリゴマー"2020

    • Author(s)
      田口精一
    • Total Pages
      7
    • Publisher
      (公益社団法人)日本農芸化学会
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  • [Book] 「食品の包装」 特集:バイオプラスチック バイオプラスチック「多元ポリ乳酸」:生産プロセスから機能部材化・生分解性まで2020

    • Author(s)
      田口精一
    • Total Pages
      12
    • Publisher
      包装食品技術協
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  • [Book] Microbial production and properties of LA-based polymers and oligomers from renewable feedstock2019

    • Author(s)
      J. M. Nduko, S. Taguchi
    • Total Pages
      30
    • Publisher
      Springer Nature
    • ISBN
      9789811337680
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  • [Book] プラスチックの資源循環に向けたグリーンケミストリーの要素技術2019

    • Author(s)
      田口精一
    • Total Pages
      336
    • Publisher
      シーエムシー出版
    • ISBN
      9784781314440
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  • [Book] 生分解性プラスチックの環境配慮設計指針2019

    • Author(s)
      田口精一、松本謙一郎
    • Total Pages
      291
    • Publisher
      シーエムシー出版
    • ISBN
      9784781314877
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  • [Book] 生分解性プラスチックの素材・技術開発~海洋プラスチック汚染問題を見据えて~2019

    • Author(s)
      田口精一、山田美和
    • Total Pages
      366
    • Publisher
      エヌ・ティー・エス出版
    • ISBN
      9784860436230
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Published: 2019-07-04   Modified: 2021-12-27  

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