New method to evaluate radiation effect by detecting structural variation
| Project/Area Number |
19K22913
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 63:Environmental analyses and evaluation and related fields
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
吉浦 孝一郎 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 教授 (00304931)
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| Project Period (FY) |
2019-06-28 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2020: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 不死化ヒト正常線維芽細胞 / 放射線 / DNA二本鎖切断 / 欠失 / 定量的測定 / ショートリード次世代シークエンサー / ロングリード次世代シークエンサー / ゲノム / ロングリードシーケンサー / 構造異常 |
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| Outline of Research at the Start |
欠失を主とした構造異常を数えることで放射線影響を測定しようとする研究である。放射線被ばくにより 50 ヶ所/グレイ照射（これまでの常識的推定値）の二本鎖切断が生じるのに対し，放射線誘発性の二本鎖切断はいくつ残るのか不明である。本研究では，この 50ヶ所/グレイ照射の修復エラー（＞比較的大きな欠失として細胞に刻印されると推察している）を検出したい，というのが基本構想である。培養による人工的構造異常導入が排除できるかが研究上の制約となる。
本研究により，構造異常を放射線被ばく指標と出来るか，実際に構造異常がどれくらいの率で惹起されるか・残るかを正確に把握しようとする研究である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，放射線照射を受けた細胞に発生するDNA二本鎖切断は，「修復されるもの」と「修復エラーで後世代に引き継がれるもの」に分けられる。このうち「後世代に引き継がれ残存する異常の実数測定」を目的とする。最終的には，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たり何個の異常が誘発され残存するのかの基盤情報を明らかにし，放射線被ばくによるゲノム異常量に基づくヒトへの放射線被ばく影響の指標化を目的とする。
BJ1-hTERT (BJ-5ta) 細胞は，human TERTによって不死化された安定正常線維芽細胞である。本細胞に0，1，3，6 Gyのγ線照射後に，選択培地なしに希釈培養することで細胞クローン化を実施した。各線量で10クローンずつ合計40クローンをpick up し，培養皿に直接SDS/ProteaseKを加えて細胞を溶解し，フェノール処理後にTE バッファーに対して透析することで，高分子DNAを抽出した。各クローンについて高分子DNA 120 ug 以上を抽出した。
2020年度は，このDNAを用いて，ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社）を使って，放射線照射によって惹起された欠失部位を網羅的に検出し，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たりの異常数を数値化する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
照射線照射後の細胞クローニングおよびDNA抽出まで順調に進んだ。
研究費の総額からして，40クローン全部を解析することは不可能であるが，充分量の細胞クローンを得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
照射線照射後の細胞クローニングおよび高分子DNA抽出まで順調に進んだ。
2020年には，ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社），可能ならば SequelII（PacBio社）を使って，放射線照射によって惹起された欠失部位を網羅的に検出し，１グレイ（Gy）当たり，１細胞当たりの異常数を数値化する。
検出された全ての部位についてPCRによる確認を進めていく方針で，可能ならば 一塩基変異と小さな（< 5 bp）の欠失/挿入の確認も行い，３機器（ショートリーソシークエンサー，ロングリードシークエンサー（Oxford Nanopore社），SequelII（PacBio社））の検出の感度・特異度なども測定したい。
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Report
(1 results)
Research Products
(25 results)
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[Journal Article] Genome analysis of myelodysplastic syndromes among atomic bomb survivors in Nagasaki2020
Author(s)
Taguchi M, Mishima H, Shiozawa Y, Hayashida C, Kinoshita A, Nannya Y, Makishima H, Horai M, Matsuo M, Sato S, Itonaga H, Kato T, Taniguchi H, Imanishi D, Imaizumi Y, Hata T, Takenaka M, Moriuchi Y, Shiraishi Y, Miyano S, Ogawa S, Yoshiura K-i, Miyazaki Y
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Journal Title
Haematologica
Volume: 105
Pages: 358-365
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Possible mitochondrial dysfunction in a patient with deafness, dystonia, and cerebral hypomyelination (DDCH) due to BCAP31 Mutation2020
Author(s)
Shimizu K, Oba D, Nambu R, Tanaka M, Oguma E, Murayama K, Ohtake A, Yoshiura KI, Ohashi H.
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Journal Title
Molecular Genetics & Genomic Medicine
Volume: 17
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Nonsense mutation in CFAP43 causes normal-pressure hydrocephalus with ciliary abnormalities.2019
Author(s)
Morimoto Y, Yoshida S, Kinoshita A, Satoh C, Mishima H, Yamaguchi N, Matsuda K, Sakaguchi M, Tanaka T, Komohara Y, Imamura A, Ozawa H, Nakashima M, Kurotaki N, Kishino T, Yoshiura K, Ono S
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Journal Title
DOI
NAID
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Identification of a novel CCDC22 mutation in a patient with severe Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis and aggressive natural killer cell leukemia2019
Author(s)
Yamashita Y, Nishikawa A, Iwahashi Y, Fujimoto M, Sasaki I, Mishima H, Kinoshita A, Hemmi H, Kanazawa N, Ohshima K, Imadome KI, Murata SI、Yoshiura KI, Kaisho T, Sonoki T, Tamura S
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Journal Title
International of Hematology
Volume: 印刷中
Pages: 358-365
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Identification of a variant-associated with early-onset diabetes in the intron of INS gene with exome sequencing.2019
Author(s)
Matsuno, S., Furuta, H., Kosaka, K., Doi, A., Yorifuji, T., Fukuda, T., Senmaru, T., Uraki, S., Matsutani, N., Furuta, M., Mishima, H., Iwakura, H., Nishi, M., Yoshiura, K., Fukui, M. and Akamizu, T.
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Journal Title
Journal of Diabetes Investigation
Volume: Epub ahead of print
Pages: 947-950
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Cystic biliary atresia with paucity of bile ducts and gene mutation in KDM6A: a case report2019
Author(s)
Masui D, Fukahori S, Mizuochi T, Watanabe Y, Fukui K, Ishii S, Saikusa N, Hashizume N, Higashidate N, Sakamoto S, Takato A, Yoshiura KI, Tanaka Y, Yagi M.
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Journal Title
Surgical Case Reports
Volume: 5(1)
Pages: 132-132
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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