Revealing the mechanism of pri-miRNA cleavage by DROSHA and DGCR8

• Project/Area Number: 19K23719
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: Kobayashi Kan 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 特任助教 (00844606)
• Project Period (FY): 2019-08-30 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: DROSHA / DGCR8 / pri-miRNA / LRPPRC / SLIRP / mRNA / miRNA

Outline of Research at the Start

本研究ではヒト由来DROSHAとDGCR8とpri-miRNAの複合体構造を決定する。DROSHA-DGCR8複合体は、目的遺伝子を含んだ組み換えバキュロウイルスをHEK293S細胞に共感染させることで発現させる。そしてアフィニティークロマトグラフィーやゲル濾過によって精製された複合体に、in vitro転写で調製したpri-miRNAを混合することでDROSHA-DGCR8-pri-miRNA複合体を再構成する。そしてクライオ電子顕微鏡でこの複合体の粒子データを取得し、単粒子解析によってその三次元構造を決定する。

Outline of Final Research Achievements

In this study, the pri-miRNA was successfully prepared by in vitro transcription, and Homo sapiens DROSHA and DGCR8 were expressed in HEK cell and their complex were purified by the affinity tag. However, the product yield of DROSHA-DGCR8 was not enough for cryo-EM analysis.
On the other hand, LRPPRC-SLIRP-mRNA was prepared and its data of cryo-EM were collected. However, the high resolution images were not obtained by data processing. It could be because of the high conformational flexibility of it.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

本研究でLRPPRC-SLIRP-mRNA複合体の調製に成功したことは、今後の構造機能解析によってそれがmRNAに結合して安定化する機構を解明する助けとなると考えられる。LRPPRCはアミノ酸変異によってLeigh Syndrome French Canadian variantと呼ばれる神経変性疾患を引き起こすことが知られている。この疾患ではミトコンドリアのmRNA量が減少することが知られているため、この疾患はLRPPRCがSLIRPとともにmRNAに結合してそれを安定化することができなくたったことによる可能性がある。そのため本研究の成果は医学的にも重要である。