| Project/Area Number |
20H02948
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
新美 友章 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (30377791)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水谷 公彦 京都大学, 農学研究科, 助教 (40314281)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2020: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
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| Keywords | シグナル伝達 / 骨芽細胞 / 再生医療 / FRET解析 / タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
骨形成を促進する働きのあるタンパク質NELL1とその受容体Robo2が結合する仕組みの解明、NELL1とRobo2の結合により誘導される下流のシグナル伝達経路（NELL-Roboシグナル）の同定を通して、NELL-Roboシグナルが骨組織形成で果たす役割を解明し、NELL1およびRobo2遺伝子やこれらの組換えタンパク質を用いた新奇骨形成因子の創成のための基盤研究を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
乳児期において頭頂骨のつなぎ目が早期に癒合する頭蓋骨縫合早期癒合症の原因遺伝子のひとつとして知られるNELL (neural EGFL-like) 1は、頭蓋顔面の骨格形成に関わる分泌タンパク質をコードしており、その骨形成作用に基づいた骨再生治療への応用が試みられている。しかし、NELL1の骨形成作用の分子基盤、特に細胞表面受容体と下流のシグナル伝達機構は不明な点が多く、臨床応用する際のボトルネックとなっている。本研究では、我々が発見したNELL1 の新奇受容体Roundabout (Robo) 2と下流のシグナル伝達経路の骨形成における役割を解明することにより、NELL1を利用した骨再生治療の基盤研究を行うことを目的とした。
NELL1の新奇受容体として同定したRobo2であるが、両者の結合はpH 6付近の弱酸性条件でのみ可能となる。すでに報告されているRobo2の結晶構造によると、Robo2の細胞外領域はヘアピン様構造をとっており、pH 7付近の生理的条件下においてはNELL1との結合部位がマスクされているためNELL1が結合できないが、pH 6付近の弱酸性条件下では、Robo2の細胞外領域のコンフォメーション変化により、NELL1が結合できるようになることを見出した。昨年度は、組換えタンパク質を用いた結合実験、蛍光共鳴エネルギー移動：Fluorescence resonance energy transfer (FRET) の変化を指標にしたRobo2 の構造解析およびサイズ排除クロマトグラフィー解析を行って得たデータを基に、酸性条件におけるRobo2の細胞外領域の推定構造と分子機構について、原著論文を執筆して報告した。Robo2の新奇受容体としてNELL1が働く分子基盤の一端が解明された本研究成果は、NELL1を利用する骨再生医療の基礎研究として重要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
NELL1の新奇受容体として同定したRobo2の組換えタンパク質を用いた結合実験を行い、酸性条件におけるRobo2の細胞外領域のコンフォメーション変化の分子機構を解明した。また、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）解析およびサイズ排除クロマトグラフィー解析により、酸性条件下におけるRobo2の推定構造を得ることに成功し、NELL1-Robo2シグナルが働く分子基盤の一端の解明に成功した。また、Robo2遺伝子の選択的スプライシング産物には、NELL1への結合活性が高いアイソフォームが存在しており、pHの変化のみでなく選択的スプライシングによってもNELL1－Robo2シグナルが制御されていることを見出した。酸性条件において、NELL1-Robo2シグナルがどのような役割を果たしているのかを解明するために、前駆骨芽細胞株の酸性条件培養法を確立して骨芽細胞への分化誘導や細胞遊走能への影響を調べているが、解答は得られていない。この点で研究の進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
NELL1-Robo2シグナルの役割の解明を目指し、前駆骨芽細胞の酸性条件培養にNELL1タンパク質を添加して、その効果を解析する。前駆骨芽細胞はRobo2を発現しているが、その発現量はあまり高くないためRobo2の安定発現株を取得して使用する。昨年度の研究で発見したNELL1への結合活性が高いRobo2の選択的スプライシング産物は、中性から弱酸性領域でもNELL1に結合することが可能なので、酸性条件培養のみならず、通常の生理的条件での培養での実験が一部可能になる。従って、選択的スプライシング産物の安定発現株を取得する。Robo2への結合はNELL1のみでなくNELL2でも可能なことを確認している。従って、NELL1-Robo2シグナルの解明のみならず、NELL2-Robo2シグナルを解明する実験系の構築を模索する。
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