| Project/Area Number |
23K05697
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
茂谷 康 徳島大学, 先端酵素学研究所, 准教授 (70609049)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | STING / 小胞体出口部位 / 小胞輸送 / ACBD3 / オルガネラコンタクト / 細胞内輸送 |
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| Outline of Research at the Start |
小胞体に局在するSTINGはゴルジ体に運ばれることで自然免疫・炎症シグナルを活性化するが、そのオルガネラ間の輸送機構は不明である。本研究では、独自に見出したオルガネラコンタクト分子ACBD3に着目し、STINGとACBD3の相互作用動態やACBD3陽性小胞体-ゴルジ体コンタクトサイトの空間特性をライブセルイメージングや空間プロテオーム解析によって解明する。この研究により、細胞内輸送の新しい原理の発見や、STING経路の破綻に起因する炎症性疾患の病態理解と制御法の確立につながることが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
STINGの小胞体からゴルジ体への輸送を正確かつ高分解能で観察するため、細胞凍結固定法と膨張顕微鏡法を組み合わせたイメージング手法を構築した。すなわち、通常のパラホルムアルデヒドやメタノールなどの化学固定では小胞体やゴルジ体などのオルガネラ膜構造が崩れ、生きた細胞の状態を反映していないという問題があったが、液化エタン・プロパンに浸漬して瞬間凍結固定する方法を用いることで細胞内膜構造が保持され、目的の膜タンパク質の正確な局在を観察することが可能になった。これによりSTINGが小胞体－ゴルジ体接触領域のみならず小胞体出口部位に移動する様子を観察することができた。このことは、小胞体－ゴルジ体接触領域タンパク質であるACBD3と小胞体出口部位タンパク質であるSec24Cを同時にノックダウンするとSTINGのゴルジ体への輸送が著しく低下する結果と一致した。さらに、その凍結固定試料をゲル化して拡張させることで微小構造のイメージングを可能にし、小胞体出口部位タンパク質が小胞体膜上のSTINGを包み込んでいる構造を捉えることに成功した。またSTING小胞体出口部位の形成に関与するタンパク質を探索するため、近接タンパク質をビオチン標識し、質量分析によって同定した。一方、小胞体－ゴルジ体接触領域を介したSTING輸送の詳細な分子機構については依然として不明であるが、輸送因子を同定するためのゲノムワイドスクリーニング系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度の方針として、蛍光タグ付きSTINGのノックイン細胞を樹立し、生きた細胞のまま超解像イメージングをすることを計画していたが、STINGにタグをつけると小胞体からゴルジ体への輸送に影響がでることが明らかとなった。すなわち、STINGの輸送機構を明らかにするためには、内在性タンパク質で解析する必要があることがわかり、この知見が得られたことは重要な成果であると考えている。そしてこの結果をもとに、生きた細胞の膜構造を保持できる凍結固定を行って内在性STINGを免疫染色し、その固定試料を拡張することで微細構造のイメージングを可能にする新しい手法を確立した。そしてこの方法を用いることで、STINGの小胞体からゴルジ体への予想外の動きを見出すことができた。以上により、おおむね順調に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
小胞体－ゴルジ体接触領域を介した輸送については、STINGを小胞体膜側からゴルジ体膜側へ移行させる実行因子は依然として不明である。そこで、CRISPR-Cas9を用いたゲノムワイドノックアウトスクリーニングによって同定を試みる。また、今回見出したSTING小胞体出口部位を介した輸送についても更なる解析を進める。近接ビオチン標識プロテオミクスによって同定したSTING小胞体出口部位の構成タンパク質の分子機能を解析するとともに、内在性レベルでSTING小胞体出口部位の電子顕微鏡観察を行う方法を模索する。
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