分必型タンパク質の膜透過の分子機構

• 研究課題/領域番号: 02404013
• 研究種目: 一般研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 機械工作
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 水島 昭二 東京大学, 応用微生物研究所, 教授 (50013313)
• 研究分担者: 内田 欣哉 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (60013330) ; 松山 伸一 東京大学, 応用微生物研究所, 助手 (50183108) ; 徳田 元 東京大学, 応用微生物研究所, 助教授 (40125943)
• 研究期間 (年度): 1990 – 1992
• 研究課題ステータス: 完了 (1992年度)
• 配分額: 31,500千円 (直接経費: 31,500千円); 1992年度: 8,200千円 (直接経費: 8,200千円); 1991年度: 9,800千円 (直接経費: 9,800千円); 1990年度: 13,500千円 (直接経費: 13,500千円)
• キーワード: タンパク質の分泌 / タンパク質の膜透過 / SecA / SecY / SecE / SecD / SecF / 再構成 / プロトン駆動力 / 大腸菌

研究概要

1.SecAタンパク質の構造と機能:NMRを用いてSecA上では前駆体タンパク質は伸びた構造をとること、疎水領域中の特定のアミノ酸側鎖がSecAの近傍にあることを明らかにした。またSecAの結晶化に成功した。
2.SecEタンパク質の機能:SecEのC末端部分のうち膜内部分が特に機能上重要であることを明らかにした。
3.SecYタンパク質の機能:SecYの全領域が活性に関与していること、SecYが膜透過にともなうプロトンの対向輸送に関与していることを示唆する結果を得た。またSecYの大量精製に成功した。
4.SecD,SecFタンパク質の機能:SecDはタンパク質の膜透過後放出に、SecFがSecDアッセンブリーに関与していることを示した。
5.再構成系の活用:再構成系を用いて分泌に関与する新膜タンパク質を発見し、SecGと名付けた。
6.シグナルペプチド各ドメインの役割:モデル分泌型タンパク質を用いてシグナルペプチドN末端の正荷電領域がSecA、膜リン脂質との相互作用で重要であることを示した。
7.膜透過される分子の構造特性:非ペプチド結合性部分を成熟体領域にもったタンクパク質でも膜透過しうることを発見した。
8.以上の成果をもとに分泌型タンパク質の膜透過の分子機構のモデルを提示した。

研究成果

• [文献書誌] M.Kato et al.: "In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive force-dependent manner." J.Biol.Chem.267. 413-418 (1992)
• [文献書誌] L.Bruncage et al.: "SecY,SecE and band 1 form the membrane-embedded domain of E.coli preprotein translocase." J.Biol.Chem.267. 4166-4170 (1992)
• [文献書誌] C.Hikita et al.: "Effects of total-hydrophobicity and length of the hydrophobic domain of a signal peptide on in vitro translocation efficiency." J.Biol.Chem.267. 4882-4888 (1992)
• [文献書誌] fK.Nishiyama et al.: "The C-terminal region of SecE interacts with SecY and is functional in the reconstitution of protein translocation activity in Escherichia coli." J.Biol.Chem.267. 7170-7176 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "Overproduction,purification and characterization of SecD and SecF,integral membrane componenst of the protein translocation machinery of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acta. 1122. 77-84 (1992)
• [文献書誌] C.Hikita et al.: "The requirement of a positive charge at the amino terminus can be compensated for by a longer central hydrophobic stretch in the functioning of signal peptides." J.Biol.Chem.267. 12375-12379 (1992)
• [文献書誌] H.Takamatsu et al.: "In vivo and in vitro characterization of the SecA gene product of bacillus subtilis." J.Bacteriol.174. 4308-4316 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "Large-scale production of membrane proteins fused to atruncated SecA in Escherichia coli." Biosce. Biotech.Biochem.56. 1512-1514 (1992)
• [文献書誌] S.Matsuyama et al.: "SecDis involved in the release of translocated secretory proteins from the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." EMBO J.12. 265-270 (1993)
• [文献書誌] Kenーichi Nishiyama: "SecY is an indispensable copmpnent of the protein secretory machinery of Escherichia coli." Biochim.Biophys.Acts. 1065. 89-97 (1991)
• [文献書誌] Jiro Akimaru: "Reconstitution of a protein secretory machinery from purified secY,SecE and SecA of Escherichia coli." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 88. 6545-6549 (1991)
• [文献書誌] Katsuko Tani: "A chemically crossーlinked nonlinear proOmoA molecule can be translocted into everted membrane vesicles of Escherichia coli in the presence of the proton motive forec." FEBS Letters. 285. 127-131 (1991)
• [文献書誌] Shoji Mizushima: "In vitro biochemical studies on translocation of presecretory proteins across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli." Methods in Cell Biol.34. 107-146 (1991)
• [文献書誌] Masashi Kato: "In vitro translocation of secretory proteins possessing no charges at the mature domain takes place efficiently in a protonmotive forceーdependent manner." J.Biol.Chem.267. 413-418 (1992)
• [文献書誌] Chinami Hikita: "Effects of totalーhydrophobicity and length of the hydrophobic domain of a signal peptide on in vitro translocation efficiency." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Kenーichi Nishiyama: "The Cーterminal region region of SecE interacts with SecY and is functional in the reconstitution of protein activity in Escherichia coli." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Chinami Hikita: "The requirement of a positive charge at the aminoーterminus can be compensated for by a longer central hydrophobic stretch in the functioning of signal peptides." J.Biol.Chem.(1992)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "In vitro kinetic analysis of the role of the positive charge at the aminoーterminal region of signal peptides in translocation of secretory protein across the cytoplasmic membrane in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 4358-4363 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Kimura,E.and Mizushima,S.: "Complementation of two overlapping fragments of SecA,a protein translocation ATPase of Escherichia coli,allows ATP binding to its aminoーterminal region." J.Biol Chem.265. 8760-8765 (1990)
• [文献書誌] Akita,M.,Sasaki,S.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "SecA interacts with secretory proteins by recognizing the positive charge at the aminoーterminus of the signal peptide in Escherichia coli." J.Biol Chem.265. 8164-8169 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Kim,Y.J.and Mizushima,S.: "In vitro protein translocation into inverted membrane vesicles prepared from Vibrio alginolyticus is stimulated by the electrochemical potential of Na^+ in the presence of Escherichia coli SecA." FEBS Letters. 264. 10-12 (1990)
• [文献書誌] Mizushima,S.and Tokuda,H.: "In vitro translocation of bacterial secretory proteins and energy requirements." J.Bioenerg.Biomemb.22. 389-399 (1990)
• [文献書誌] Matsuyama,S.,Akimaru,J.and Mizushima,S.: "SecEーdependent overproduction of SecY in Escherichia coli:Evidence for interaction between two components of the secretory machinery." FEBS Letters. 269. 96-100 (1990)
• [文献書誌] Shiozuka,K.,Tani,K.,Mizushima,S.and Tokuda,H.: "The proton motive force lowers the level of ATP required for the in vitro translocation of a secretory protein in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 18843-18847 (1990)
• [文献書誌] Tani,K.,Tokuda,H.and Mizushima,S.: "Translocation of proOmpA possessing an intramolecular disulfide bridge into membrane vesicles of Escherichia coli:Effect of membrane energization." J.Biol.Chem.265. 17341-17347 (1990)
• [文献書誌] Tokuda,H.,Shiozuka,K.and Mizushima S.: "Reconstitution of translocation activity for secretory proteins from solubilized components of Escherichia coli." Eur.J.Biochem.192. 583-589 (1990)
• [文献書誌] Shinkai,A.,Akita,M.,Matsuyama,S.and Mizushima,S.: "Quantitative renaturation from a guanidineーdenatured state of the SecA dimer,a 200 kDa protein involved in protein secretion in Escherichia coli." Biochem.Biophys.Res.Commun.172. 1217-1223 (1990)
• [文献書誌] Yamane,K.,Akiyama,Y.,Ito,K.and Mizushima,S.: "A positively charged region is a determinant of the orientation of cytoplasmic membrane proteins in Escherichia coli." J.Biol.Chem.265. 21166-21171 (1990)