| 研究課題/領域番号 |
06660101
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
小林 達彦 京都大学, 農学部, 講師 (70221976)
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| 研究分担者 |
片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494)
清水 昌 京都大学, 農学部, 教授 (70093250)
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| 研究期間 (年度) |
1994 – 1995
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| 研究課題ステータス |
完了 (1995年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
1995年度: 400千円 (直接経費: 400千円)
1994年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | ニトリルヒドラターゼ / Rhodococcus / 遺伝子 / プロモーター / アミダ-セ / トランスポザ-ゼ / 誘導 / クロトンアミド / 塩基配列 / 転写開始点 |
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| 研究概要 |
Rhodococcus rhodochrous J1が生成する高分子量型ニトリルヒドラターゼ(H-NHase)および低分子量型ニトリルヒドラターゼ(L-NHase)について、各々対応する遺伝子(nhhBAおよびnhIBA)の発現に関わる調節領域の特定を行った。
(1)H-NHase遺伝子(nhhBA)について、Rhodococcus属の宿主ベクター系を用いて、nhnBAの発現に必須の4.6kbの領域の塩基配列を決定した結果、本領域には、大腸菌由来の調節遺伝子marRやhpcRと相同性を示す遺伝子nhhDとPseudomonas aeruginosaのアミダーゼの負の調節遺伝子であるamiCと相同性を示す遺伝子nhhCが存在した。各遺伝子の領域をプローブとしたノーザン解析により、これらの調節遺伝子がnhhBAの(尿素などの)アミド化合物による誘導発現において転写レベルでの制御に関わることが明かとなった。また、プライマー伸長法により、nhhBAのmRNAへの転写は開始コドンより上流71ペース及び48ペースの2点より始まることが判明し、プロモーター領域の特定に成功した。さらに、本4.5kbの領域とともにnhhBAをRhodococcus-E. coiシャトルベクターpK4に導入し、Rhodococcs rhodochrous ATCC12674を形質転換した結果、その無細胞抽出液の50%以上をH-NHaseが占めていることが判明した。一方、上記2種類の調節遺伝子とnhhBAの間に認められた挿入配列IS1164は、nhhBAの発現調節には関与しないことが明らかとなった。
(2)L-NHase遺伝子(nhlBA)について、本遺伝子を含むDNA断片に対する種々のデリーションフラグメントを作製し、Rhodococcusの宿主ベクター系を用いて解析した結果、nhlBAより上流部分を少なくとも約3.5kb含むクローンは全てインデューサーであるクロトンアミドによりL-NHaseを誘導生成したのに対し、上流領域をさらに切り縮めたクローンはクロトンアミドの有無に関わらずL-NHaseが構成的に発現することが判明した。クロトンアミドによる誘導発現に関わる上流領域には、二つのORF(nhlDとnhlC)が存在した。nhlDは水銀、カドミウム、ひ素などの重金属を解毒あるいは細胞外へ排出する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子の(上流に存在する)発現調節に関わるタンパク質と相同性を示した。nhlCは、(H-NHaseの構造遺伝子の4.2kb上流に存在し、H-NHaseの発現に必要な遺伝子である)nhhCの相同遺伝子であると考えられた。各形質転換体におけるL-NHaseの生成をSDS-PAGE及びL-NHaseに対する抗体を用いたウエスタンブロットで検討した結果、nhlDまでを全て含むクローンはクロトンアミドを含む培養条件でのみL-NHaseが発現したのに対し、nhlDあるいはnhlCを欠失させたクローンはどちらの条件でも構成的にL-NHaseが発現した。
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