| 研究概要 |
本研究では,大麻に含まれる3種の生理活性カンナビノイ(THCA,CBDA,CBCA)の大量調整法の確立を検討した.
まず最初に精製したTHCA合成酵素及びCBDA合成酵素をプロテアーゼやCNBrを用いて部分分解し,各フラグメントのN末端シークエンスを行うことにより,内部アミノ酸配列を決定した.これらとともに,別途決定していた両酵素のN末端アミノ酸配列を基に,プライマーを作成し,PCRを試みた.なお,THCA合成酵素及びCBDA合成酵素の遺伝子クローニングにはそれぞれメキシコ種アサ及びCBDA種アサからmRNAを抽出し,逆転写により合成したcDNAを使用した.これらを用いてdegeneratePCR,5'-RACE,3'-RACEを行った結果,両酵素をコードする遺伝子のクローニングに成功した.THCA合成酵素及びCBDA合成酵素の遺伝子はそれぞれ1635bp,1632bpのopen reading frameを有し,推定アミノ酸配列は互いに84%という高いホモロジーを示した.また両酵素は,berberine bridge enzymeにも約40%ホモロジーを示すことが判明した.
さらにクローニングした遺伝子を用いて酵素の発現系の確立を試みた.まず最初に両酵素の遺伝子を発現ベクター(pET-28)に組み込み,大腸菌中で発現を行ったが,誘導されたタンパク質にはいずれもカンナビノイド合成活性は認められなかった.そこで,THCA合成酵素遺伝子をpYE22mに組み込み,酵母で発現を行ったところ,酵素活性を有する組み換えタンパク質の誘導に成功した.CBDA合成酵素遺伝子の発現に関しては,同様の酵母による発現系を構築中である.また,CBDA合成酵素の遺伝子クローニング,CBCAの大量発現系に関しては現在検討中である.
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