| 研究課題/領域番号 |
11460048
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
古川 謙介 九州大学, 農学研究院, 教授 (90221556)
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| 研究分担者 |
後藤 正利 九州大学, 農学研究院, 助手 (90274521)
吉野 貞蔵 九州大学, 農学研究院, 助教授 (80117291)
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| 研究期間 (年度) |
1999 – 2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
12,000千円 (直接経費: 12,000千円)
2001年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2000年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
1999年度: 8,800千円 (直接経費: 8,800千円)
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| キーワード | オキシゲナーゼ / ハイブリッド酵素 / DNAシャフリング / 基質特異性 / 分解遺伝子 / アルキルベンゼン / 分子進化工学 / ダイオキシン / ジオキシゲナーゼ / Pseudomonas / PCB / 遺伝子シャフリング / 芳香族炭化水素代謝 / ジベンゾフラン |
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| 研究概要 |
芳香族炭化水素への初期酸素添加に関与する酵素(オキシゲナーゼ)は末端酸素添加酵素(大小サブユニット)とNADHからの電子伝達系(フェレドキシン及びその還元酵素)から成る多成分酵素である。本研究では、まず、大サブユニットが基質特異性に関与することを明らかにした。ついで分解機能の異なるPseudomonas pseudoalcaligenes KF707株とBurkhoderia cepacia LB400株の二つのビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット(BphAl)遺伝子間でDNAシャフリング法を適用した。即ち、両bphAl遺伝子をPCRにより増幅、DNAaseIで10-50bpに分解、プライマーを入れないPCR、ついでプライマーを用いたPCRにより、KF707-bpAlとLB400-bpAlのキメラ遺伝子を構築した。これを大腸菌で他の遺伝子と共発現させて、キメラ酵素の機能を解析した。その結果、DNAシャフリングにより、各種ポリ塩化ビフェニル(PCB)に対して2,3-dioxygenation及び3,4-dioxygenationの両反応により効率よく分解する酵素が得られた。また、親酵素が分解できないベンゼン、トルエンを分解できる新規な酵素、諸種のアルキルベンゼンに高い分解能を示す酵素が得られた。
次にKF707BphAl遺伝子についてランダムヘキサオリゴマー利用した変異を行った。その結果、KF707株酵素が分解できないジベシゾフラン、ジベンゾ-p-ダイオキシンに対してlateral dioxygenation及びangular dioxygenationの両反応により酸化できる変異酵素が得られた。
上記の改変酵素のアミノ酸配列を決定し、新規な分解能獲得に関与するアミノ酸配列を同定し、素の構造と分解能について考察した。
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