| 研究課題/領域番号 |
13660170
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
林産学
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
田中 裕美 近畿大学, 農学部, 教授 (30140338)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2004年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2003年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2002年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2001年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | ラッカーゼ / 軟腐朽 / フェノールオキシダーゼ / 木材腐朽 / 一電子酸化活性 / 水酸化ラジカル / フェノルオキシダーゼ |
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| 研究概要 |
軟腐朽機構を解明するために、リグニン分解に関与するラッカーゼを分離・精製し、物理化学的諸性質を検討するために以下の実験を行った。
1.木材分解力が大きくて、しかもラッカーゼ活性の高い軟腐朽菌Graphium sp.M-1-9を選抜した。
2.供試菌をブナ木片添加培地で培養後、菌体外分泌物質を抽出し、硫安沈殿物を得た。
3.2.で得られたサンプルをオープンカラムによってPhenyl Sepharoseで疎水クロマトグラフィー、DEAE Sepharose CL-6Bを用いてイオン交換クロマトグラフィー、FPLCによってHiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPカラムで疎水クロマトグラフィーを行った。SDS-PAGEを行うとバンドが2本確認されたので、さらにSuperdex 75PC3.2/30によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、2本のピークを得た。ただし、この段階になるとサンプル量が極めてわずかになるので、以下の実験にはこの前の段階でのサンプルを使用した。
4.HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPカラムによる疎水クロマトグラフィー後のサンプルを用いて、SDS-PAGEを行った後、PVDF膜に転写し、染色後タンパク質のバンドを切り出した。それを用いてプロテインシーケンサーによりN末端アミノ酸配列を解析したが、解析できなかった。N末端がブロックされている可能性が考えられたので、バンドから抽出後、内部消化したものを解析する予定である。
5.HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPカラムによる疎水クロマトグラフィー後のサンプルを用いて、数種の質を用いてK_m、V_<max>を求めた。また最適pHは4.5であった。
6.収量は少ないが、白色腐朽菌と同様の低分子の水酸化ラジカル生成糖ペプチドを分離した。この物質は一電子酸化活性があり、その活性は水酸化ラジカルによるものであることがわかった。このことから、軟腐朽菌も白色腐朽菌と同様、リグニン分解酵素と水酸化ラジカル生成糖ペプチドが協奏的に作用して木材を分解する。
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