IκBアンチセンス遺伝子導入による肝虚血再灌流傷害抑制法の開発と肝移植への応用

• 研究課題/領域番号: 13671342
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 消化器外科学
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 島津 元秀 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70124948)
• 研究分担者: 篠田 昌宏 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (50286499) ; 高柳 淳 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (80245464)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 4,000千円 (直接経費: 4,000千円); 2002年度: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円); 2001年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
• キーワード: IκB / NFκB / アンチセンス / 遺伝子導入 / 肝虚血再灌流障害 / 肝移植 / IkB / NFkB / 肝虚血再灌流傷害

研究概要

炎症性サイトカインあるいはapoptosisの制御に重要な役割を果たしているNFkBの抑制は,apoptosisの助長を介して虚血・再灌流傷害の増悪につながるとの自験結果から,NFkB活性化による傷害軽減効果を期待し,IkB antisense遺伝子導入による傷害抑制法の開発に着想した.さらに生体肝移植を行った臨床例において炎症性サイトカインを指標として虚血・再灌流傷害の評価を行った.NFkB活性化の手段としてIkBのmRNAを不活化させるアンチセンス法を採用し,IkB antisense cDNAを発現するアデノウイルスベクター(Adex IkB antisense)を作製した.遺伝子導入法としてCOS-TPC法を用いて,組み換えアデノウイルスを作製した.Adex IkB antisenseを実際にラットに感染させる前にin vitroにて作用発現の有無と力価を確認した.(1)ヒト肝癌細胞Hep-G2(2)ヒト腎癌細胞KU19-20(3)ヒト腎癌細胞Caki-1の各培養細胞に対して20-40MOIのウィルスを感染させた.コントロールとしてAdex β galを用い,経時的にIkB antisense cDNAをRT-PCRで,細胞内IkB量をwestern blot法を用いて,また活性化NF-kB量はgel shift assay法にて測定・比較した.結果,感染2日目でantisense cDNAが細胞内に確認されているにもかかわらずIkB蛋白量の明らかな減少を認めなかった.その理由としてNF-kBに結合したIkBの安定性の問題,antisenseの蛋白合成阻害の不確実性などが考えられた.解決法として細胞内antisenseを定常的に存在させることによりIkB発現を抑えることをねらい,2日毎にAdex IkB antisenseを再感染させ,1週間後にIkBを定員したところ,やはりIkBの蛋白発現を安定して抑えることができなかった.また,NFkB核内活性化蛋白の定量でもNFkBの活性化を証明できなかった.同時に進めていたin vivo(ラット)での肝温虚血再灌流傷害実験でもウィルス感染群はコントロール群に比べ肝障害を軽減することができなかった.今後はRNAi法を用いて検討する予定である.

研究成果

• [文献書誌] Morisue A, Wakabayashi G, et al.: "The role of Nitric Oxide after a short period of liver ischemia-reperfusion"J Surg Res. 109. 101-109 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shinoda M, Shimazu M, et al.: "Tumor necrosis factor suppression and microcirculatory disturbance amelioration in ischemia/reperfusion injury of rat liver after ischemic preconditioning"J Gastroenterol Hepatol. 17. 1211-1219 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Harada H, Wakabayashi G, et al.: "Transfer of Interleukin-1 receptor antagonist gene into rat liver abrogates hepatic ischemia-reperfusion injury"Transplantation. 74. 1434-1441 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shinoda M, Shimazu M, et al.: "c-Jun N-terminal kinase activation during warm hepatic ischemia/reperfusion injuries in a rat model"Wound Repair Regen. 10. 314-319 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yamamoto S, Shimazu M, et al.: "The Role of Tumor Necrosis Factor-α and Interleukin-1β in Ischemia-Reperfusin Injury of the Rat Small Intestine"J Surg Res. 99. 134-141 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kato Y, Shimazu M, et al.: "Significance of Portal Venous Flow in Graft Regeneration After Living Liver Transplantation"Transplant Proc. 33. 1484-1485 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Shimazu M: "Trends in Gastroenterology and Hepatology"Ed. By Asakura H, Aoyagi Y and Nakazawa S, Springer Verlag. 370 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Morisue,A, Wakabayashi,G, Shimazu,M, Mukai,M, Matsumoto,K, Kawachi,S, Yoshida,M, Yamamoto,S, Kitajima,M: "The role of Nitric Oxide after a short period of liver ischemia-reperfusion"J Surg Res. 109. 101-109 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shinoda,M, Shimazu,M, Wakabayashi,G, Tanabe,M, Hoshino,K, Kitajima,M: "Tumor necrosis factor suppression and microcirculatory disturbance amelioration in ischemia/reperfusion injury of rat liver after ischemic preconditioning"J Gastroenterol Hepatol. 17. 1211-1219 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Harada,H, Wakabayashi,G, Takayanagi,A, Shimazu,M, Matsumoto,K, Obara,H, Shimizu,N, Kitajima,M: "Transfer of the Interleukin-1 receptor antagonist gene into rat liver abrogates hepatic ischemia-reperfusion injury"Transplantation. 74. 1434-1441 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Shinoda,M, Shimazu,M, Matsuda,S, Wakabayashi,G, Tanabe,M, Hoshino,K, Kamei,S, Koyasu,S, Kitajima,M: "c-Jun N-terminal kinase activation during warm hepatic ischemia/reperfusion injuries in a rat model"Wound Repair Regen. 10. 314-319 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yamamoto,S, Tanabe,M, Wakabayashi,G, Shimazu,M, Matsumoto,K, Kitahjima,M: "The Role of Tumor Ncrosis Factor-α and Interleukin- 1β in Ischemia-Reperfusion Injury of the Rat Small Intestine. Journal of Surgical Research, 99 : 134-141, 2001"J Surg Res. 99. 134-141 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kato,Y, Shimazu,M, Walabayashi,G, Tanabe,M, Morikawa,Y, Hoshino,K, Harada,H, Kadomura,T, Obara,H, Urakami,H, Shinoda,M, Kitajima,M: "Significance of Portal Venous Flow in Graft Regeneration After Living Liver Transplantation"Transplant Proc. 33. 1484-1485 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Tanabe M, Shimazu M, Wakabayashi G, et al.: "Intraportal infusion therapy as a novel approach to adult ABO-incompatible liver transplantation"Transplantation. 73. 1959-1961 (2002)
• [文献書誌] Kawachi S, Shimazu M, Wakabayashi G, et al.: "Biliary complications in adult living donor liver transplantation with duct-to-duct hepaticocholedochostomy or Roux-en-Y hepaticojejunostomy biliary"Surgery. 132. 48-56 (2002)
• [文献書誌] Shinoda M, Shimazu M, Matsuda S, et al.: "c-Jun N-terminal kinase activation during warm hepatic ischemia/reperfusion injuries in a rat model"Wound Repair Regen. 10. 314-319 (2002)
• [文献書誌] Shinoda M, Shimazu M, Wakabayashi G, et al.: "Tumor necrosis factor suppression and microcirculatory disturbance amelioration in ischemia/reperfusion injury of rat liver after ischemic preconditioning"J Gastroenterol Hepatol. 17. 1211-1219 (2002)
• [文献書誌] Yoshida M, Wakabayashi G, Ishikawa H, et al.: "Arteriovenous shunting blood flow in the stomach is intravitally observed only ofter thermal injury in rats"Keio J Med. 51. 193-200 (2002)
• [文献書誌] Harada H, Wakabayashi G, Takayanagi A, et al.: "Transfer of the Interleukin-1 receptor antagonist gene into rat liver abrogates hepatic ischemia-reperfusion injury"Transplantation. 74. 1434-1441 (2002)
• [文献書誌] Obara H, Shimazu M, et al.: "Overexpression of Truncated IκBα Induces TNF-α-Dependent Apoptosis in Human Vascular Smooth Muscle Cells"Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19. 2198-2204 (2000)
• [文献書誌] Yamamoto S, Shimazu M, et al.: "The Role of Tumor Necrosis Factor-α amd Interleukin-1β in Ischemia-Reperfusin Injury of the Rat Small Intestine"Journal of Surgical Research. 99. 134-141 (2001)
• [文献書誌] 篠田 昌宏, 島津 元秀, ほか: "肝虚血再灌流障害に対するischemic preconditioning(IPC)とその機序"侵襲と免疫. 9. 18-23 (2000)
• [文献書誌] 篠田 昌宏, 島津 元秀, ほか: "各種病態に対する生体肝移植周術期におけるサイトカイン変動の検討"移植. 36. 159-165 (2001)
• [文献書誌] Shimazu M: "Trends in Gastroenterology and Hepatology"Ed. By Asakura H, Aoyagi Y and Nakazawa S, Springer Verlag. 370 (2001)