| 研究課題/領域番号 |
13854003
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| 研究種目 |
基盤研究(S)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
長棟 輝行 東京大学, 大学院・工学研究科, 教授 (20124373)
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| 研究分担者 |
上田 宏 東京大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (60232758)
新海 政重 東京大学, 大学院・工学研究科, 講師 (70262889)
河原 正浩 東京大学, 大学院・工学研究科, 助手 (50345097)
神谷 典穂 東京大学, 大学院・工学系研究科, 助手 (50302766)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2005
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| 研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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| 配分額 *注記 |
118,040千円 (直接経費: 90,800千円、間接経費: 27,240千円)
2005年度: 11,830千円 (直接経費: 9,100千円、間接経費: 2,730千円)
2004年度: 11,700千円 (直接経費: 9,000千円、間接経費: 2,700千円)
2003年度: 11,700千円 (直接経費: 9,000千円、間接経費: 2,700千円)
2002年度: 34,970千円 (直接経費: 26,900千円、間接経費: 8,070千円)
2001年度: 47,840千円 (直接経費: 36,800千円、間接経費: 11,040千円)
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| キーワード | キメラ受容体 / 抗原濃度依存的細胞増殖 / ライブラリースクリーニング / 抗体可変領域分泌細胞 / エレクトロスプレー堆積法 / 抗体マイクロアレイ / 抗体 / 受容体 / ライブラリー / 抗体生産 / プロテインチップ |
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| 研究概要 |
エリスロポエチン受容体のリガンド認識部位を抗ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)抗体の可変領域V_H、 V_Lで置換したキメラ受容体HE、 LEと、その細胞内ドメインをIL-6受容体のサブユニットであるgp130で置換したキメラ受容体Hg、 Lgを作製した。また、HgのVH部分あるいは細胞外ドメインを抗フルオレセインー本鎖抗体で置換した種々のキメラ受容体も作製した。これらV_H/V_L型およびScFv型2つのキメラ受容体を細胞に導入した結果、抗原添加によって遺伝子導入細胞を選択的に増殖させることに成功した。
そこで、V_H/V_L型受容体で最もクリアなHEL依存性が見られたHg+LEの組み合わせについて、 V_Hの抗原認識部分の4アミノ酸をランダムに置換した発現ベクターを作製し、LEを発現させた細胞へ導入しHELで選択した。得られた変異V_Hは、野生型V_Hとほぼ同等のHELへの結合活性を示した。また、抗原としてSOD(superoxide disnmutase)を選び、免疫したマウスの脾臓細砲ライブラリーからPCR法によりVH部分を増幅し、gp130の細胞外ドメインを置換する形で組み込んだ。このライブラリーを細胞に導入し、抗原であるSODを加えて選択培養を続けたところ増殖したクローンが得られ、ライブラリー選択できる可能性が示唆された。
また、キメラ受容体発現ベクターの受容体遺伝子の前後にloxP配列を組み込み、抗原選択後にCreリコンビナーゼを発現させることで、選択されたキメラ受容体発現細胞を抗体可変領域分泌細胞に変換する系の構築にも成功した。さらに、エレクトロスプレー法によってガラス基板(9mmx9m)上に直径150μm程度の抗体の均一なスポット324個を作製する技術を開発した。この抗体マイクロアレイを用いたサンドイッチELISA法により0.1〜1ng/ml以上の測定感度で抗原濃度を再現性良く測定することに成功した。
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