新規in vivo可視化技術を用いた真核細胞における遺伝情報発現機構の解析

• 研究課題/領域番号: 13GS0013
• 研究種目: 学術創成研究費
• 配分区分: 補助金
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 古久保 哲朗 横浜市立大学, 大学院・国際総合科学研究科, 教授 (10271587)
• 研究分担者: 白川 昌宏 京都大学, 工学研究科, 教授 (00202119)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 340,210千円 (直接経費: 282,640千円、間接経費: 57,570千円); 2005年度: 78,650千円 (直接経費: 60,500千円、間接経費: 18,150千円); 2004年度: 80,080千円 (直接経費: 61,600千円、間接経費: 18,480千円); 2003年度: 90,740千円 (直接経費: 69,800千円、間接経費: 20,940千円); 2002年度: 90,740千円 (直接経費: 90,740千円)
• キーワード: 転写調節 / モニタリング / 遺伝子発現 / イメージング / NMR / MRI / ポリリン酸 / レポーター遺伝子

研究概要

すべての生命現象は必要な遺伝情報がプログラム通りに正しく発現することにより支えられている。遺伝子発現プログラムにおいて最も重要な制御段階は「転写」であり、その制御反応に関与する蛋白質の多くはすでに同定されたと考えられるが、それらの生体内における作用機構の詳細は依然として明らかではない。本研究の目的は、生物個体における遺伝子発現を非破壊的に計測する新規手法の開発を行い、その手法を用いて真核細胞の転写制御を支える分子的基盤及びその作動原理を明らかにすることである。
無機リン酸のポリマーであるポリリン酸は、全ての生物に普遍的に存在し、^<31>P-NMRによる定量的なマイクロイメージングが可能であることから、遺伝子発現量をモニターする上で非常に有効なプローブになりうるものと考えられる。これまで我々は、出芽酵母、動物培養細胞、動物・植物個体を宿主とし、ポリリン酸合成酵素(または合成・蓄積に関与するタンパク質)を新規レポーター遺伝子として用いてプロモーター活性を効率よくモニタリングできる手法の開発を進めてきた。今年度は、^<31>P-MRI測定系の検出限界を打破するべく、T_1緩和時間の変化を^1H-MRIにより画像化する新規モニタリング手法の開発を行った。別途開発を進めてきた自動コロニースポッターと組み合わせることにより、少なくとも出芽酵母においては、極めて短時間に上流活性化配列(UAS)、及びコアプロモーター配列の決定を行うことが可能となった。

研究成果

• [雑誌論文] A novel magnetic resonance-based method to measure gene expression in living cells (2006)
  • 著者名/発表者名: S.Ki, F.Sugihara, K.Kasahara, H.Tochio, A.Okada-Marubayashi, S.Tomita, M.Morita, M.Ikeguchi, M.Shirakawa, T.Kokubo
  • 雑誌名: Nucleic Acids Research (印刷中)
• [雑誌論文] Crystal structure of SUMO-3-modified thymine-DNA glycosylase (2006)
  • 著者名/発表者名: D.Baba, N.Maita, J.G.Jee, Y.Uchimura, H.Saitoh, K.Sugasawa, F.Hanaoka, H.Tochio, H.Hiroaki, M.Shirakawa
  • 雑誌名: Journal of Molecular Biology (印刷中)
• [雑誌論文] Resonance assignments of 30 kDa complexes of TFIID subunit TAF1 with TATA-binding protein (2005)
  • 著者名/発表者名: TK.Mal, D.Liu, Y.Masutomi, L.Zheng, Y.Nakatani, T.Kokubo, M.Ikura
  • 雑誌名: Journal of Biomolecular NMR 33・1 ページ: 76-76
• [雑誌論文] Crystal structure of thymine DNA glycosylase conjugated to SUMO-1 (2005)
  • 著者名/発表者名: D.Baba, N.Maita, J.G.Jee, Y.Uchimura, H.Saitoh, K.Sugasawa, F.Hanaoka, H.Tochio, H.Hiroaki, M.Shirakawa
  • 雑誌名: Nature 435・7044 ページ: 979-982
• [雑誌論文] Plc1p, Arg82p, and Kcs1p, enzymes involved in inositol pyrophosphate synthesis, are essential for phosphate regulation and polyphosphate accumulation in Saccharomyces cerevisiae (2005)
  • 著者名/発表者名: C.Auesukaree, H.Tochio, M.Shirakawa, Y.Kaneko, S.Harashima
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 280・26 ページ: 25127-33
• [雑誌論文] In vivo synthesis of Taf1p lacking the TAF N-terminal domain using alternative transcription or translation initiation sites. (2004)
  • 著者名/発表者名: K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo
  • 雑誌名: Genes to Cells 9・8 ページ: 709-721
• [雑誌論文] Autonomous function of the amino-terminal inhibitory domain of TAF1 in transcriptional regulation. (2004)
  • 著者名/発表者名: S.Takahata, K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo
  • 雑誌名: Molecular and Cellular Biology 24・8 ページ: 3089-3099
• [雑誌論文] Structure of the N-terminal domain of PEX1 AAA-ATPase : characterization of a putative adaptor-binding domain (2004)
  • 著者名/発表者名: Shiozawa, K.他(全9名中、Shirakawa, M.第8名)
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 279・48 ページ: 50060-50068
• [雑誌論文] Structural basis for distinct roles of Lys63- and Lys48-linked polyubiquitin chains. (2004)
  • 著者名/発表者名: Tenno, T.他(全10名中、Shirakawa, M.第10名)
  • 雑誌名: Genes to Cells 9・10 ページ: 865-875
• [雑誌論文] Structure of human MTH1, a Nudix family hydrolase that selectively degrades oxidized purine nucleoside triphosphates. (2004)
  • 著者名/発表者名: Mishima, M.他(全10名中、Shirakawa, M.第10名)
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 279・32 ページ: 33806-33815
• [雑誌論文] Structure of the UBA domain of Dsk2p in complex with Ubiquitin : Molecular Determinants for ubiquitin Recognition
  • 著者名/発表者名: Ohno, A., 他(全9名中、Shirakawa, M.第9名)
  • 雑誌名: Structure (印刷中)
• [文献書誌] S.Takahata, K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Autonomous function of the amino-terminal inhibitory domain of TAF1 in transcriptional regulation."Molecular and Cellular Biology. 24・8(in press). (2004)
• [文献書誌] A.Kobayashi, T.Kokubo, Y.Ota, S.Yokoyama: "Promoter-specific function of the TATA element in undifferentiated P19 cells."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 310・2. 458-463 (2003)
• [文献書誌] S.Takahata, H.Ryu, K.Ohtsuki, K.Kasahara, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Identification of a novel TATA element-binding protein binding region at the N terminus of the Sacchaoomyces cerevisiae TAF1 protein."Journal of Biological Chemistry. 278・46. 45888-45902 (2003)
• [文献書誌] H.Ohdate, C.R.Lim, T.Kokubo, K-i.Matsubara, Y.Kimata, K.Kohno: "Impairment of the DNA-binding activity of the TATA-binding protein (TBP) renders the transcriptional function of Rvb2p/Tih2p, the yeast RuvB-like protein, essential for cell growth."Journal of Biological Chemistry. 278・17. 14647-14656 (2003)
• [文献書誌] A.Kobayashi, T.Miyake, M.Kawaichi, T.Kokubo: "Mutations in the histone fold domain of the TAF12 gene show synthetic lethality with the TAF1 gene lacking the TAF N-terminal domain (TAND) by different mechanisms from those in the SPT15 gene encoding the TATA binding protein (TBP)."Nucleic Acids Research. 31・4. 1261-1274 (2003)
• [文献書誌] C.Auesukaree, T.Homma, H.Tochio, M.Shirakawa, Y.Kaneko, S.Harashima: "Intracellular phosphate serves as a signal for the regulation of the PHO pathway in Saccaromyces cerevisiae"Journal of Biological Chemistry. (in press). (2004)
• [文献書誌] K.Fujiwara, T.Tenno, K.Sugasawa, J.-G.Jee, I.Ohki, C.Kojima, H.Tochio, H.Hiroaki, F.Hanaoka, M.Shirakawa: "Structure of the ubiquitin-interacting motif of S5a bound to the ubiquitin-like domain of HR23B"Journal of Biological Chemistry. 279・6. 4760-4767 (2004)
• [文献書誌] N.Goda, T.Tenno, H.Takasu, H.Hiroaki, M.Shirakawa: "The PRESAT-vector. Asymmetric T-vector for high throughput screening of soluble protein domains for structural proteomics"Protein Science. 13・3. 652-658 (2004)
• [文献書誌] Z.Kato, J.-G.Jee, H.Shikano, M.Mishima, I.Ohki, H.Ohnishi, A.Li, K.Hashimoto, E.Matsukuma, K.Omoya, Y.Yamamoto, T.Yoneda, T.Hara, N.Kondo, M.Shirakawa: "The structure and binding mode of interleukin-18"Nature Structural Biology. 10・11. 966-971 (2003)
• [文献書誌] M.Mishima, S.Takayama, K.Sasaki, J.-G.Pee, C.Kojima, A.Isogai, M.Shirakawa: "Structure of the male determinant factor for Brassica self-incompatibility"Journal of Biological Chemistry. 278・38. 36389-36395 (2003)
• [文献書誌] S.Watanabe, T.Ichimura, N.Fujita, S.Tsuruzoe, I.Ohki, M.Shirakawa, M.Kawasuji, M.Nakao: "Methylated DNA-binding domain 1 and methylpurine-DNA glycosylase link transcriptional repression and DNA repair in chromatin"Proceedings of National Academy of Sciences USA. 100・22. 12859-12864 (2003)
• [文献書誌] Kobayashi, A., Akasaka, K., Kawaichi, M., Kokubo, T: "Functional interaction between TATA and upstream CACGTG elements regulates the temporally specific expression of Otx mRNAs during early embryogenesis of the sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus"Nucleic Acids Research. 30・14. 3034-3044 (2002)
• [文献書誌] Kobayashi, A., Miyake, T., Kawaichi, M., Kokubo, T: "Mutations in the histone fold domain of the TAF12 gene show synthetic lethality with the TAF1 gene lacking the TAF N-terminal domain (TAND) by different mechanisms from those in the SPT15 gene encoding the TATA binding protein (TBP)"Nucleic Acids Research. 31・4. 1261-1274 (2003)
• [文献書誌] Takahashi, M., Maraboeuf, F., Sakai, Y., Yakushiji, H., Mishima, M., 他: "Role of tryptophan residues in the recognition of mutagenic oxidized nucleotides by human antimutator MTH1 protein"Journal of Molecular Biology. 319. 129-139 (2002)
• [文献書誌] Sasaki, Y., Furuichi, M., Takahashi, M., Mishima, M., Iwai, S., 他: "A molecular basis for the selective recognition of 2-hydroxy-dATP and 8-oxo-dGTP by human MTH1"Journal of Biological Chemistry. 277. 8579-8587 (2002)
• [文献書誌] Kouno, T., Miura, K., Kanematsu, T., Shirakawa, M., Hirata, M., 他: "1H, 13C and 15N resonance assignments of GABARAP, GABAA receptor associated protein"Journal of Biomolecular NMR. 22. 97-98 (2002)
• [文献書誌] Yoshihiro Tsukihashi: "Requiement for yeast TAF145 function in transcriptional activation of the RPS5 promoter that depends on both core promoter structure and upstream activating sequences"Journal of Biological Chemistry. 276・28. 25715-25726 (2001)