| 研究概要 |
annexin V発現ベクターの作製:誘導型,非誘導型annexin V発現ベクターを作製した.この発現ベクターによりannexin Vが誘導されることが,annexin V特異的抗体を用いたWestern blot, ELISAにより示された.
annexin V発現による形態学的変化:annexin V発現によっても癌細胞株には肉眼的に形態学的変化は起こらなかった.
annexin V誘導によるPKC活性の抑制:TPAによるPKC活性化が,annexin V誘導により抑制される可能性が示された.
関与するアイソフォームはPKCδである可能性が高いことが判明した.
annexin V高発現によってもphenotypeが生じないため,その発現機構の解明により,annexin Vの機能に迫るという研究方針とした.
annexin V誘導の機序についての検討
蛋白合成阻害剤であるcycloheximide (CHX), anisomycin (ANI)はc-fos, c-junなどある種のmRNA発現を強力に誘導し,この現象はsuperinductionと称されている.この現象に着目し,各種癌細胞株におけるannexin Vの発現と機序について検討した.LightCyclerを用いたTaqMan法によるOne-step real-time quantitative RT-PCR法を確立しannexin V mRNAを定量した.24時間のCHX刺激は各種癌細胞株(MCAS, HHUA, MCF7, T47D, TYK, OVK18, T47D)におけるannexin V mRNAをsuperinduceした.同様にANI刺激は癌細胞株(MCAS, HHUA, MCF7)におけるannexin V mRNAをsuperinduceした.特に卵巣癌細胞株MCASにおいてはPKC activator (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)刺激は,CHXによるsuperinductionを増強し,PKC inhibitor (bisindolylmaleimide I)とRNA synthesis inhibitor (actinomycin D)により抑制された.また,ANIはmitogen-activated protein kinase (MAPK)の強力なactivatorでもあり,MCASにおけるannexin V発現とMAPKとの関係についてWestern blotting法とquantitative RT-PCR法を用いて検討した.ANI刺激によりERK1/2,p38 MAPKは5分後からリン酸化を認め,そのリン酸化は24時間後まで続いた.また,ERK1/2 inhibitor (PD98059,U0126),p38MAPK inhibitor (SB203580)によってそれぞれのリン酸化が抑制された.ERK1/2 inhibitorsはannexin V mRNAのsuperinductionを抑制したが(PD98059,50%,U0126;9.8%),p38 inhibiorは抑制しなかった.以上より,(1)蛋白合成阻害剤(CHX, ANI)はannexin V mRNAをsuperinductionすること.(2)CHXによるannexin VのsuperinductionはPKCを介して増強され,かつmRNA転写レベルの活性化によること.(3)ANIによるannexin VのsuperinductionはERK1/2 signal pathwayを介したsignal伝達の活性化によること.が判明した.以上から通常annexin Vの発現には転写因子レベルで負の制御が働いており,PKCを介してannexin Vの発現が誘導されることが示唆された.
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