| 研究課題/領域番号 |
15F15090
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 外国 |
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| 研究分野 |
応用生物化学
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
木村 淳夫 北海道大学, 農学研究院, 教授 (90186312)
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| 研究分担者 |
MANEESAN JANJIRA 北海道大学, 農学研究院, 外国人特別研究員
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| 研究期間 (年度) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2016年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2016年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2015年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 糖質酵素 / 高基質濃度 / 伸長作用 / 阻害 |
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| 研究実績の概要 |
目的は、花バチのスクラーゼ（SUCase）と多糖合成酵素（PSase）が示す新しい現象の分子解析と応用である。SUCaseの優れた特徴は基質阻害と生成物阻害が極めて低く「高基質濃度で活発に反応できる点」にある。この低阻害に関わる構造因子を決定し、高基質濃度で高活性な酵素を作製する。PSaseは多糖を糖転移と糖鎖伸長で合成するが、我々は「両反応が別個の部位で生じる」と推測した。その理由は、C末端領域を除去すると糖鎖伸長のみが低下したからである。現在、支持されている機構は「両反応が活性部位の１箇所で触媒」である。C末領域の糖鎖伸長に関わる構造因子を決定し、一般説を精査する。また、新規サイズの糖質を生産できる有用PSaseを作製する。
SUCaseの阻害解除現象に関与する残基としてGlnとLeuを昨年度明らかにした。さらにTyrを含めた多重変異体を評価した。GlnとLeu、TyrとGln、LeuとTyrの各置換による２重変異酵素、Gln・Leu・Tyrを置換した３重変異酵素を作製した。高濃度ショ糖への活性を測定すると、Gln→Asn／Leu→Hisに親酵素より大きい阻害解除が観察され、基質阻害や生成物阻害を低減させた置換酵素の取得に成功した。一方、立体構造は得られなかったが、相同酵素の構造からGlnとLeuは活性部位の近傍に存在が推定された。相同酵素の塩依存性活性化も解析した。
PSaseのC末端除去実験から候補アミノ酸を推定した。変異導入により伸長反応が低下したので、本残基を糖鎖伸長の第２の構造因子と推察した。しかし、完全に伸長現象が消失していないので、さらなる構造因子の存在が考えられる。生成物のサイズ分析から長鎖型オリゴ糖の生成を確認した。酵素結晶が得られなかった。その理由として分子量が10万を超える巨大タンパク質であることが考えられた。転移の新たな反応機構を提案した。
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| 現在までの達成度 (段落) |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度が最終年度であるため、記入しない。
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