耐熱性リフォールディング触媒の開発と抗体産生への応用

• 研究課題/領域番号: 15K14695
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 応用微生物学
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 田村 隆 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (40253009)
• 研究期間 (年度): 2015-04-01 – 2018-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2017年度)
• 配分額: 3,900千円 (直接経費: 3,000千円、間接経費: 900千円); 2017年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円); 2016年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円); 2015年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
• キーワード: disulfide oxidoreductase / Thermus thermophilus / redox tuning / GFP / antibody / redox motif / ジスルフイド架橋 / 高度好熱菌 / 緑色蛍光タンパク質 / リフォールディング / グルタチオン / ジスルフィド異性化酵素 / 変性タンパク質 / 酸化還元電位 / ジスルフィド架橋

研究成果の概要

本研究ではタンパク質をゆでながら巻き戻す高温リフォールディング技術の開発に取り組んだ。正しい立体構造の回復に依存して緑色蛍光を発するsfGFP-2SSを作成した。これを還元的に変性させた後，酸化剤により誤った架橋を形成させると蛍光は失われた。これを基質として高温条件での巻き戻しを実現するために耐熱性PDIにより，高温リフォールディング技術PTR法を確立した。PTRとは，高温と低温の温度サイクルにより変性タンパク質を正しい構造へと導くタンパク質のPCRである。病因分子を認識する抗体が医薬品として利用されており，複数のジスルフィド架橋を正しく導入する方法として展開が見込まれる。

研究成果

• [雑誌論文] Structural and mechanistic insights into homocysteine degradation by a mutant of methionine γ-lyase based on substrate-assisted catalysis (2017)
  • 著者名/発表者名: Sato D, Shiba T, Yunoto S, Furutani K, Fukumoto M, Kudou D, Tamura T, Inagaki K, Harada S.
  • 雑誌名: Protein Science 巻: 26 号: 6 ページ: 152-158
  • DOI: 10.1002/pro.3158
  • NAID: 130007628790
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The hyperthermophilic cystathionine γ-synthase from the aerobic crenarchaeon Sulfolobus tokodaii: expression, purification, crystallization and structural insights (2017)
  • 著者名/発表者名: Sato D, Shiba T, Mizuno S, Kawamura A, Hanada S, Yamada T, Shinozaki M, Yanagitani M, Tamura T, Inagaki K, Harada S
  • 雑誌名: Acta Cryst., F 巻: 73 号: 3 ページ: 152-158
  • DOI: 10.1107/s2053230x17002011
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A non-radioactive assay for selenophosphate synthetase activity using recombinant pyruvate pyrophosphate dikinase from Thermus thermophilus HB8 (2016)
  • 著者名/発表者名: Kamada, S., Okugochi, T., Asano, K., Tobe, R., Mihara, H., Nemoto, M., Inagaki, K., and Tamura, T.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 80 号: 10 ページ: 1970-1972
  • DOI: 10.1080/09168451.2016.1200458
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification and Characterization of the zosA Gene Involved in Copper Uptake in Bacillus subtilis 168 (2016)
  • 著者名/発表者名: Fukuhara, T., Kobayashi, K., Kanayama, Y., Enomoto, S., Kondo, T., Tsunekawa, N., Nemoto, M., Ogasawara, N., Inagaki, K., and Tamura, T.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem 巻: 80 号: 3 ページ: 600-609
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1107462
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Epistasis effects of multiple ancestral-consensus amino acid substitutions on the thermal stability of glycerol kinase from Cellulomonas sp. NT3060. (2016)
  • 著者名/発表者名: Fukuda, Y., Abe, A., Tamura, T., Kishimoto, T., Sogabe, A., Akanuma, S., Yamagishi, A., Imada, K., and Inagaki, K
  • 雑誌名: J. Biosci. Bioeng 巻: 121 号: 5 ページ: 497-502
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2015.09.011
  • NAID: 40020838799
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular evolution of gas cavity in [NiFeSe] hydrogenases resurrected in silico (2016)
  • 著者名/発表者名: Takashi Tamura, Naoki Tsunekawa, Michiko Nemoto, Kenji Inagaki, Toshiyuki Hirano, Fumitoshi Sato
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 6 号: 1
  • DOI: 10.1038/srep19742
  • NAID: 120005723278
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 量子化学計算が解き明かすピリドキサール酵素の反応機構 (2016)
  • 著者名/発表者名: 田村 隆
  • 雑誌名: ビタミン 巻: 90 ページ: 281-285
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reactivity of sorbose dehydrogenase from Sinorhizobium sp. 97507 for 1,5-anhydro-D-glucitol. (2015)
  • 著者名/発表者名: Araki T., Nakatsuka T., Kobayashi F., Watanabe-Ishimaru E., Sanada H., Tamura T., Inagaki K.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: Epub ahead of print 号: 7 ページ: 1130-1132
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1012148
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recombinant expression, molecular characterization and crystal structure of antitumor enzyme, l-lysine α-oxidase from Trichoderma viride. (2015)
  • 著者名/発表者名: Amano M, Mizuguchi H, Sano T, Kondo H, Shinyashiki K, Inagaki J, Tamura T, Kawaguchi T, Kusakabe H, Imada K, Inagaki K.
  • 雑誌名: J Biochem. 巻: 157 号: 6 ページ: 1-11
  • DOI: 10.1093/jb/mvv012
  • NAID: 110010000888
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Draft genome sequence of Streptomyces incarnatus NRRL8089, which produces the nucleoside antibiotic sinefungin (2015)
  • 著者名/発表者名: Oshima, K., Hattori, M., Shimizu, H., Fukuda, K., Nemoto, M., Inagaki, K., and Tamura, T
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 3 号: 4
  • DOI: 10.1128/genomea.00715-15
  • NAID: 120005672474
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Molecular Cloning and Characterrization of L-Methionine γ-Lyase from Streptomyces avermitilis. (2015)
  • 著者名/発表者名: Kudou, D., Yasuda, E., Hirai, Y., Tamura, T., and Inagaki, K.
  • 雑誌名: Journal of Bioscience and Bioengineering 巻: Epub ahead of print 号: 4 ページ: 380-383
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2015.02.019
  • 査読あり
• [学会発表] 高度好熱菌由来PDIのタンパク質の高温リフォールディング活性 (2017)
  • 著者名/発表者名: 平島史崇，倉光成紀,根本理子，稲垣賢二，田村 隆
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] ジスルフィド架橋導入sfGFPを用いた蛍光回復過程の経時変化 (2016)
  • 著者名/発表者名: 平島史崇，福山慎也，根本理子，稲垣賢二，田村 隆
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 横浜
• [学会発表] ジスルフィド架橋導入sfGFPを用いた高温リフォールディング評価法 (2015)
  • 著者名/発表者名: 福山慎也，森野智美，根本理子，稲垣賢二，田村 隆
  • 学会等名: 日本分子生物学会
  • 発表場所: 神戸
  • 年月日: 2015-12-01
• [備考] 微生物遺伝子化学研究室web site
  • URL: http://www.agr.okayama-u.ac.jp/ApplEnz/