研究課題/領域番号 |
16791028
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研究種目 |
若手研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
研究分野 |
耳鼻咽喉科学
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研究機関 | 関西医科大学 |
研究代表者 |
永田 基樹 関西医科大学, 医学部, 助手 (10340712)
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研究期間 (年度) |
2004 – 2005
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研究課題ステータス |
完了 (2005年度)
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配分額 *注記 |
3,400千円 (直接経費: 3,400千円)
2005年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2004年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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キーワード | 蝸牛 / 内有毛細胞 / 外有毛細胞 / 一酸化窒素 / Ca2+ / feedback / p2 receptor / inner hair cell / nitric oxide / neuronal nitric oxide synthase / auditory neurotransmission / Ca^<2+> influx / cochlea / ATP |
研究概要 |
本研究では単離したモルモットの内有毛細胞を用い、NOのATP刺激により細胞内Ca^<2+>上昇に対する抑制作用のメカニズムを調べ、更に求心性の内有毛細胞内カルシウムへのnegative feedback作用に関わるNOの産生酵素を同定し、内耳求心性聴覚情報伝達機構におけるNO作用の解明を目的にしている。DAF-2を用いた実験で、ATP刺激によって、内有毛細胞において経時的なDAF-2の蛍光強度の増加すなわちNOの産生が見られた。このNO産生は非特異的NOS阻害剤であるL-NAME及びP2 receptorのantagonistであるsuramin, calmodulinのantagonistであるcalmidazoliumによって抑制された。Ca^<2+>-freeの場合はATP刺激によるNOの産生が認められなかった。NOとCa^<2+>同時測定の実験で、ATP刺激によって、内有毛細胞の細胞内Ca^<2+>濃度上昇後にNO産生が観察された。Fura-2を用いた実験で、ATP刺激による内有毛細胞内Ca^<2+>濃度の上昇はL-NAMEによって増強されたが、NO donorであるSNAPによって抑制された。更にATPによるCa^<2+>反応は膜透過型cGMPである8-Br-cGMPに抑制されたが、NOの標的酵素soluble guanylyl cyclase(sGC)の抑制剤であるODQ及びcGMP-依存性protein kinase(PKG)の抑制剤であるKT5823によって増強された。また、選択的nNOSの阻害剤である7-NIは非特異的NOS阻害剤であるL-NAMEと同程度にATP刺激によるNOの産生を抑制し、同程度にATP刺激によるCa^<2+>反応を増加した。単離した内有毛細胞を持ち、nNOSとeNOS、ATPのreceptorであるP2x2とnNOSとの二重免疫蛍光染色を行い、その結果、nNOSは細胞内に均一分布したeNOSと違って、内有毛細胞の頂部(apical region)に強く存在し、それにnNOSとP2X2は内有毛細胞の頂部に共存した。それぞれの免疫反応の特異性は蝸牛組織の蛋白抽出物を用い、western blotで確認した。以上の事から、ATPによるNOの産生は、P2 receptorの活性化によりCa^<2+>の流入がおこり、結果細胞内Ca^<2+>濃度が上昇し、nNOSが活性化され、NO産生が惹起された。惹起されたNOは、NO/cGMP/PKG経路を介して、negative feedbackにATPによるCa^<2+>の細胞内への流入を抑制したと考えられた。
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