独自のノックダウンマウス作製法の応用と新たな実験系の提案

• 研究課題/領域番号: 16H04685
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 実験動物学
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 大塚 正人 東海大学, 医学部, 准教授 (90372945)
• 研究分担者: 中村 伸吾 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究施設、病院並びに防衛, 防衛医学研究センター 医療工学研究部門, 講師 (00505323) ; 幸谷 愛 東海大学, 医学部, 教授 (00517477) ; 角田 茂 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345032)
• 研究協力者: 三浦 浩美
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円); 2018年度: 5,460千円 (直接経費: 4,200千円、間接経費: 1,260千円); 2017年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円); 2016年度: 6,500千円 (直接経費: 5,000千円、間接経費: 1,500千円)
• キーワード: ノックダウン / miRNA / 遺伝子治療 / トランスジェニック / マウスモデル / 発生工学

研究成果の概要

本研究では、ターゲットトランスジェネシス法を利用した独自の遺伝子ノックダウン技術を主軸として、その実用性と汎用性の向上を目指した。具体的には、1) 組織特異的にmiRNA発現をオン→オフにすることによるコンディショナル遺伝子発現リカバリー法の開発、2) 天然miRNAのコンディショナル発現マウスの作製と解析、3) 内在性遺伝子イントロンへのmiRNA挿入が、遺伝子治療に応用できるかの検討、を進めた。独自の系を用いて上述した研究に有用な全てのマウスリソースの開発に成功し、現在その解析を進めているところである。

研究成果の学術的意義や社会的意義

本研究は独自の遺伝子ノックダウン（機能の抑制）法、独自の遺伝子改変マウス作製法を応用した新たな実験系を提案するものであり、今回、その解析に有用なマウスモデルの開発に成功した。これにより、マウスの体内でより洗練された遺伝子発現のコントロールを行うことが可能となると期待される。それは、これまでに知られていなかった個体レベルでの遺伝子の機能を見出すことにも繋がるものであり、さらに最近話題となっているゲノム編集技術を応用し、将来的な新規遺伝子治療技術開発にも結びつくものと言える。

研究成果

• [国際共同研究] ジョージア大学(米国)
• [国際共同研究] University of Nebraska, Medical Center(米国)
• [国際共同研究] The University Of Nebraska(米国)
• [雑誌論文] Intravenous Delivery of piggyBac Transposons as a Useful Tool for Liver-Specific Gene-Switching (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Shingo、Ishihara Masayuki、Watanabe Satoshi、Ando Naoko、Ohtsuka Masato、Sato Masahiro
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 19 号: 11 ページ: 3452-3452
  • DOI: 10.3390/ijms19113452
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Isolation and Analysis of a Genome-Edited Single-Hepatocyte from a Cas9 Transgenic Mouse Line (2018)
  • 著者名/発表者名: Sakurai Takayuki、Kamiyoshi Akiko、Ohtsuka Masato、Gurumurthy Channabasavaiah B.、Sato Masahiro、Shindo Takayuki
  • 雑誌名: Methods in Molecular Biology 巻: 1874 ページ: 257-271
  • DOI: 10.1007/978-1-4939-8831-0_15
  • ISBN: 9781493988303, 9781493988310
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors (2018)
  • 著者名/発表者名: Miura H, Quadros RM, Gurumurthy CB, Ohtsuka M
  • 雑誌名: Nat Protoc. 巻: 13 号: 1 ページ: 195-215
  • DOI: 10.1038/nprot.2017.153
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Bone marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and -dependent manners under hypoxic culture (2017)
  • 著者名/発表者名: Takizawa N, Okubo N, Kamo M, Chosa N, Mikami T, Suzuki K, Yokota S, Ibi M, Ohtsuka M, Taira M, Sasaki D, Yaegashi T, Ishisaki A, Kyakumoto S
  • 雑誌名: Experimental Cell Res. 巻: 358 号: 2 ページ: 411-420
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2017.07.014
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins (2017)
  • 著者名/発表者名: Quadros RM, Miura H, Harms DW, Akatsuka H, Sato T, Aida T, Redder R, Richardson GP, Inagaki Y, Sakai D, Buckley SM, Seshacharyulu P, Batra SK, Behlke MA, Zeiner SA, Jacobi AM, Izu Y, Thoreson WB, Urness LD, Mansour SL, Ohtsuka M, Gurumurthy CB
  • 雑誌名: Genome Biology 巻: 18 号: 1 ページ: 92-92
  • DOI: 10.1186/s13059-017-1220-4
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (PITT) (2016)
  • 著者名/発表者名: Schilit S.L.P., Ohtsuka M., Quadros R. and Gurumurthy C.B.
  • 雑誌名: Curr. Protoc. Hum. Genet. 巻: 91 号: 1
  • DOI: 10.1002/cphg.23
  • 査読あり / 国際共著 / 謝辞記載あり
• [学会発表] Development of a reporter mouse model suitable for evaluation of in vivo genome editing efficiency (2018)
  • 著者名/発表者名: H Miura, CB Gurumurthy, M Ohtsuka
  • 学会等名: 2018 Cold Spring Harbor meeting: Genome Engineering: The CRISPR/Cas Revolution
  • 国際学会
• [学会発表] ゲノム編集効率評価系モデルマウスの開発と評価 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三浦 浩美、佐藤 正宏、水谷 晃子、大塚 正人
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] piggyBac系ベクターのハイドロダイナミクス遺伝子導入法はマウス肝臓での導入遺伝子の持続発現と肝細胞でのgene switchingを可能とする (2018)
  • 著者名/発表者名: 中村 伸吾、渡部 聡、石原 雅之、安藤 尚子、大塚 正人、佐藤 正宏
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] CRISPR solution for creating Cre-LoxP genetics resources (2017)
  • 著者名/発表者名: Rolen M Quadros, Hiromi Miura, Masato Ohtsuka, Donald W Harms, Channabasavaiah B Gurumurthy
  • 学会等名: Genome Engineering: The CRISPR-Cas Revolution（CSHL Meetings & Courses Program）
  • 国際学会
• [学会発表] Development of a mouse model suitable for in vivo genome editing efficiency studies (2017)
  • 著者名/発表者名: Hiromi Miura, Yutaka Inagaki, Channabasavaiah B Gurumurthy, Masahiro Sato, Masato Ohtsuka
  • 学会等名: 14th Transgenic Technology Meeting (TT2017)
  • 国際学会
• [学会発表] In vivoゲノム編集効率評価系モデルマウスの開発 (2017)
  • 著者名/発表者名: 三浦 浩美、稲垣 豊、佐藤 正宏、大塚 正人
  • 学会等名: 第40回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 新規遺伝子改変マウス作製方法：PITT, Easi-CRISPR, GONAD (2017)
  • 著者名/発表者名: 大塚正人
  • 学会等名: 第３回川島カンファレンス
  • 招待講演
• [学会発表] Easi-CRISPR：高効率なノックインマウス作製法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 三浦 浩美、Gurumurthy Channabasavaiah、相田 知海、稲垣 豊、佐藤 正宏、佐藤 健人、大塚 正人
  • 学会等名: 第39回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-11-30
• [学会発表] Generation of knockdown mice using PITT and Easi-CRISPR (2016)
  • 著者名/発表者名: Ohtsuka M.
  • 学会等名: MicroRNAs/Noncoding & Genome Engineering/Editing and Europe -2016
  • 発表場所: Peterhouse University of Cambridge（Cambridge, UK）
  • 年月日: 2016-11-01
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 長い一本鎖DNAを用いたノックインマウス作製 (2016)
  • 著者名/発表者名: 三浦 浩美、Channabasavaiah Gurumurthy、稲垣 豊、大塚 正人
  • 学会等名: 平成28年度新学術領域研究「学術研究支援基盤形成【先端モデル動物支援プラットフォーム】」若手支援技術講習会
  • 発表場所: 蓼科グランドホテル滝の湯（長野県茅野市）
  • 年月日: 2016-09-14
• [学会発表] Easi-CRISPR：長鎖一本鎖DNAを用いた高効率ノックイン法 (2016)
  • 著者名/発表者名: 大塚正人，相田知海，三浦浩美，Channabasavaiah Gurumurthy
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第1回大会
  • 発表場所: 広島国際会議場（広島県広島市）
  • 年月日: 2016-09-06
• [図書] PITT法によるターゲットトランスジェニックマウス作製 in 動物／疾患モデルの作製技術・病態解析・評価手法 (2017)
  • 著者名/発表者名: 大塚正人、三浦浩美
  • 総ページ数: 428
  • 出版者: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861046650
• [備考]
  • URL: http://masato2.wixsite.com/ohtsuka-lab
• [備考] 東海大学医学部基礎医学系分子生命科学 大塚研究室
  • URL: http://masato2.wixsite.com/ohtsuka-lab
• [産業財産権] Dna editing using single-stranded dna (2016)
  • 発明者名: C B GURU, H Miura, M Ohtsuka
  • 権利者名: The Univ. Nebraska, Tokai Univ.
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2016-06-03
  • 外国