均一な糖鎖を持つバイオ医薬品の微生物酵素を用いた革新的生産技術

• 研究課題/領域番号: 16K07698
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用生物化学
• 研究機関: 石川県立大学
• 研究代表者: 山本 憲二 石川県立大学, 生物資源環境学部, 特任教授 (70109049)
• 研究分担者: 加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2018年度)
• 配分額: 4,810千円 (直接経費: 3,700千円、間接経費: 1,110千円); 2018年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円); 2017年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円); 2016年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
• キーワード: バイオ医薬品 / 糖鎖 / エンドグリコシダーゼ / 糖転移反応 / リモデリング / インターフェロン-γ / インターロイキン-３ / Pichia pastoris / エンドーＭ / インターロイキン３ / インターフェロンーγ / エンド-M / インターロイキン-3 / エンド-Ｍ

研究成果の概要

バイオ医薬品である糖タンパク質のヒト由来インターフェロン-γおよびインターロイキン-3について、合成DNAを用いてPichia酵母による組換え糖タンパク質の発現に成功した。得られた組換え糖タンパク質の糖鎖にEndo-Hを作用して高マンノース型糖鎖を切断遊離し、これを受容体としてヒト型糖鎖のシアロ複合型糖鎖を糸状菌のエンドグリコシダーゼ（Endo-M）の変異酵素の糖転移活性を活用して付加し、糖鎖のリモデリングを行ってヒトに適応したバイオ医薬品の創製を試みたが、目的の生成物は少量しか得られなかった。そこで、糖転移反応の効率化を図るためにEndo-Mの分子サイズの縮小化を試みたが、成功しなかった。

研究成果の学術的意義や社会的意義

バイオ医薬品の多くは動物細胞を用いて調製されているが、多量生産が困難であり、糖タンパク質であるためにタンパク質は同一であっても薬効に影響を与える糖鎖の構造が不均一である故に同じ医薬品でも糖鎖構造の違いによって薬効に差が生じる。本研究の成果によって、多量生産できる微生物の酵母を用いてヒト由来サイトカインなどのバイオ医薬品の多量調製が可能であることが明らかになった事実は今後のバイオ医薬品の製造に有用な意義を持つ。さらに本研究では充分な成果を得ることができなかったが、本研究が微生物の酵素を用いたリモデリング法によって均一な糖鎖をもつバイオ医薬品を多量調製する技術開発に示唆を与えた学術的意義は大きい。

研究成果

• [雑誌論文] グライコエンジニアリングのツール：鍵酵素 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山本憲二
  • 雑誌名: 未来を創るグライコサイエンス 巻: 0 ページ: 26-27
  • 査読あり
• [雑誌論文] Bifunctional properties and characterization of a novel sialidase with esterase activity from Bifidobacterium bifidum (2018)
  • 著者名/発表者名: Ashida H, Tanigawa K, Kiyohara M, Katoh T, Katayama T, Yamamoto K
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: 82 号: 11 ページ: 2030-2039
  • DOI: 10.1080/09168451.2018.1497944
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chemo-enzymatic synthesis of the glucagon containing N-linked oligosaccharide and its characterization. (2018)
  • 著者名/発表者名: Higashiyama, T., Umekawa, M., Nagao, M., Katoh, T., Ashida, H., Yamamoto, K.
  • 雑誌名: Carbohydrate Research 巻: 455 ページ: 92-96
  • DOI: 10.1016/j.carres.2017.11.007
  • 査読あり
• [雑誌論文] Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy (2018)
  • 著者名/発表者名: Mimura, Y., Katoh, T., Saldova R, O’Flaherty, R., Izumi, T., Mimura-Kimura, Y., Utsunomiya, T., Mizukami, Y., Yamamoto, K., Matsumoto, T., Rudd, PM.
  • 雑誌名: Protein Cell. 巻: 9（1） 号: 1 ページ: 47-62
  • DOI: 10.1007/s13238-017-0433-3
  • NAID: 120006398892
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Specificity of donor structures for endo-beta-N-acetylglucosaminidase-catalyzed transglycosylation reactions. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishii, N., Ogiwara, K., Sano, K., Kumada, J., Yamamoto, K., Matsuzaki, Y., Matsuo, I.
  • 雑誌名: ChemBioChem, 巻: 19 号: 2 ページ: 136-141
  • DOI: 10.1002/cbic.201700506
  • 査読あり
• [雑誌論文] Chemo-enzymatic synthesis of a glycosylated peptide containing a complex N-glycan based on unprotected oligosaccharides by using DMT-MM and Endo-M. (2017)
  • 著者名/発表者名: Tomabechi, Y., Katoh, T., Kunishima, M., Inazu, T., Yamamoto, K
  • 雑誌名: Glycoconjugate Journal 巻: 34 号: 4 ページ: 481-487
  • DOI: 10.1007/s10719-017-9770-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transglycosidase-like activity of Mucor hiemalis endoglycosidase mutants enabling the synthesis of glycoconjugates using a natural glycan donor. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sakaguchi, K., Katoh, T.,Yamamoto, K.
  • 雑誌名: Biotechnology and Applied. Biochemistry 巻: X 号: 6 ページ: 812-819
  • DOI: 10.1002/bab.1433
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Generation of a mutant Mucor hiemalis endoglycosidase that prefers core-fucosylated N-glycans. (2016)
  • 著者名/発表者名: Katoh, T., Katayama, T., Tomabechi, Y., Nishikawa, Y., Kumada, J., Matsuzaki, Y., Yamamoto, K
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 291 号: 44 ページ: 23305-23317
  • DOI: 10.1074/jbc.m116.737395
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Complete NMR assignment of a bisecting hybrid-type oligosaccharide transferred by Mucor hiemalis endo-β-N-acetylglucosaminidase (2016)
  • 著者名/発表者名: T. Yamanoi, Y. Oda, K. Katsuraya, T. Inazu, K. Yamamoto
  • 雑誌名: Carbohydrate Research 巻: 427 ページ: 60-65
  • DOI: 10.1016/j.carres.2016.03.013
  • NAID: 120006483209
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] コアフコースを有する糖鎖に作用するENGase探索に向けた蛍光プローブの合成 (2019)
  • 著者名/発表者名: 松尾一郎、石井希美、永田光穂、佐野加苗、加藤紀彦、山本憲二、飯野健太、松崎祐二、西川宣秀
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会
• [学会発表] 糖鎖と微生物の関わり合い (2018)
  • 著者名/発表者名: 山本憲二
  • 学会等名: 糖質研究コンソーシアム
  • 招待講演
• [学会発表] 酵母を発現宿主とした組換え糖タンパク質の調製とEndo-Mによる糖鎖構造の均一化 (2017)
  • 著者名/発表者名: 苫米地祐輔・加藤紀彦・坂口広大・千葉靖典・熊田純一・松崎祐二・山本憲二
  • 学会等名: 日本農芸化学会2017年度大会
  • 発表場所: 京都女子大学（京都府・京都市）
  • 年月日: 2017-03-18
• [学会発表] 微生物の特異なエンドグリコシダーゼを活用した創薬 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山本憲二
  • 学会等名: 日本薬学会創薬懇話会
  • 招待講演
• [学会発表] Endo-M酵素を用いたグルコース七残基分岐β-CyDへのＮ-結合型糖鎖の集積化. (2017)
  • 著者名/発表者名: 苫米地祐輔・中川純樹・渡邊幹夫・小田慶喜・山本憲二・山ノ井孝.
  • 学会等名: 第36回日本糖質学会年会
• [学会発表] エンドグリコシダーゼの糖鎖転移活性を利用するネオグライコ酵素の創製とリソソーム病治療薬開発. (2017)
  • 著者名/発表者名: 伊藤孝司・西岡宗一郎・小林功・笠嶋めぐみ・原園景・松崎祐二・飯野健太・山本憲二・灘中里美・北川裕之・日高朋・辻大輔・石井明子・瀬筒秀樹.
  • 学会等名: 第36回日本糖質学会年会
• [学会発表] 微生物の応用から見た糖鎖 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本憲二
  • 学会等名: 糖鎖科学中部拠点、第13回「若手の力」フォーラム
  • 発表場所: 岐阜大学（岐阜県・岐阜市）
  • 年月日: 2016-11-26
  • 招待講演
• [学会発表] 改変型Endo-Mによるトランスグリコシレーション法の改良と応用 (2016)
  • 著者名/発表者名: 山本憲二
  • 学会等名: 第35回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 高知市文化プラザ（高知県高知市）
  • 年月日: 2016-09-03
  • 招待講演
• [学会発表] コアフコースを有するN-結合型糖鎖に作用するエンドM変異酵素の作出 (2016)
  • 著者名/発表者名: 加藤紀彦・片山高嶺・苫米地祐輔・岩城隼・熊田純一・松崎祐二・山本憲二
  • 学会等名: 第35回日本糖質学会年会
  • 発表場所: 高知市文化プラザ（高知県高知市）
  • 年月日: 2016-09-02
• [学会発表] トリアジン型脱水縮合剤とEndo-Mを用いた糖タンパク質の合成 (2016)
  • 著者名/発表者名: 苫米地祐輔、山本憲二、加藤紀彦、国嶋 崇隆, 山田 耕平, 加藤 大輝、稲津敏行
  • 学会等名: ENGase研究会
  • 発表場所: 高知市文化プラザ（高知県高知市）
  • 年月日: 2016-08-30
• [図書] 中分子創薬に資するペプチド・核酸・糖鎖の合成技術. (2018)
  • 著者名/発表者名: 加藤紀彦・山本憲二.
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: シーエムシー出版
• [図書] BIO Clinica (2017)
  • 著者名/発表者名: 苫米地祐輔・加藤紀彦・山本憲二.
  • 総ページ数: 3
  • 出版者: 北隆館
• [図書] Medical Science Digest. (2016)
  • 著者名/発表者名: 苫米地祐輔・加藤紀彦・山本憲二
  • 総ページ数: 4
  • 出版者: ニューサイエンス社