CRISPRライブラリーを用いたグルコシルセラミドの脂質二重膜間輸送因子の探索

• 研究課題/領域番号: 17K07357
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 山地 俊之 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (50332309)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 4,940千円 (直接経費: 3,800千円、間接経費: 1,140千円); 2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2018年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2017年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
• キーワード: スフィンゴ糖脂質 / ゲノム編集 / スクリーニング / ゴルジ体 / 糖脂質 / ゲノムワイドスクリーニング / 脂質輸送 / 糖鎖 / 脂質 / 膜輸送

研究成果の概要

本研究では、CRISPRノックアウトスクリーニングを用いて、スフィンゴ糖脂質輸送に影響を及ぼす新規因子の探索を行った。Vero細胞を用いたスクリーニングにおいて、ゴルジ体に局在する複数回膜貫通タンパクSYS1の同定に成功した。SYS1の遺伝子ノックアウトにより、志賀毒素受容体糖脂質Gb3の低下と、グルコシルセラミドの大幅な増加が見られた。またSYS1のノックアウト細胞においてゴルジ体の形態変化、及びトランスゴルジネットワークマーカーのTGN46の局在変化を示した。このことからSYS1はゴルジ体及びトランスゴルジネットワークの輸送に関与することで、糖鎖生合成を制御することを明らかにした。

研究成果の学術的意義や社会的意義

スフィンゴ糖脂質は、高次機能や疾患に深く関与することが知られており、生体に欠かせない脂質である。スフィンゴ糖脂質の生合成酵素はほぼ同定されているものの、細胞内輸送因子に関しては未解明な点が残されており、代謝・輸送に関する因子の同定は重要な課題である。本研究により、ゴルジ体における糖鎖生合成の制御に関して重要な知見を得ており、糖鎖生物学及び細胞生物学的分野における学術的意義を示すものである。

研究成果

• [雑誌論文] Golgi maturation-dependent glycoenzyme recycling controls glycosphingolipid biosynthesis and cell growth via GOLPH3. (2021)
  • 著者名/発表者名: Riccardo Rizzo, Domenico Russo, Kazuo Kurokawa, Alfredo Budillon, Franck Perez, Seetharaman Parashuraman, Yusuf A Hannun, Akihiko Nakano, Daniela Corda, Giovanni D’Angelo and Alberto Luini et al.,.
  • 雑誌名: The EMBO Journal 巻: 40 号: 8
  • DOI: 10.15252/embj.2020107238
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of SYS1 as a Host Factor Required for Shiga Toxin-Mediated Cytotoxicity in Vero Cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Sakuma Chisato、Sekizuka Tsuyoshi、Kuroda Makoto、Hanada Kentaro、Yamaji Toshiyuki
  • 雑誌名: Int J Mol Sci 巻: 22 号: 9 ページ: 4936-4936
  • DOI: 10.3390/ijms22094936
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Poliovirus-nonsusceptible Vero cell line for the World Health Organization global action plan (2021)
  • 著者名/発表者名: Okemoto-Nakamura Y, Someya K, Yamaji T, Saito K, Takeda M, Hanada K
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 11 号: 1 ページ: 6746-6746
  • DOI: 10.1038/s41598-021-86050-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Galabiosylceramide is present in human cerebrospinal fluid (2021)
  • 著者名/発表者名: Akiyama H, Ide M, Yamaji T, Mizutani Y, Niimi Y, Mutoh T, Kamiguchi H, Hirabayashi Y.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 536 ページ: 73-79
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.12.051
• [雑誌論文] Concise and Reliable Syntheses of Glycodendrimers via Self-Activating Click Chemistry: A Robust Strategy for Mimicking Multivalent Glycan?Pathogen Interactions (2020)
  • 著者名/発表者名: Farabi K, Manabe Y, Ichikawa H, Miyake S, Tsutsui M, Kabayama K, Yamaji T, Tanaka K, Hung S-C, Fukase K.
  • 雑誌名: J Org Chem 巻: 85 号: 24 ページ: 16014-16023
  • DOI: 10.1021/acs.joc.0c01547
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identification of Characteristic Genomic Markers in Human Hepatoma HuH-7 and Huh7.5.1-8 Cell Lines (2020)
  • 著者名/発表者名: Kawamoto M#, Yamaji T#, Saito K, Shirasago Y, Satomura K, Endo T, Fukasawa M, Hanada K, Osada N.
  • 雑誌名: Front Genet 巻: 11 ページ: 546106-546106
  • DOI: 10.3389/fgene.2020.546106
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Sphingomyelin Is Essential for the Structure and Function of the Double-Membrane Vesicles in Hepatitis C Virus RNA Replication Factories (2020)
  • 著者名/発表者名: Gewaid H, Aoyagi H, Arita M, Watashi K, Suzuki R, Sakai S, Kumagai K, Yamaji T, Fukasawa M, Kato F, Hishiki T, Mimata A, Sakamaki Y, Ichinose S, Hanada K, Muramatsu M, Wakita T, Aizaki H.
  • 雑誌名: J Virol 巻: 94 号: 23
  • DOI: 10.1128/jvi.01080-20
  • 査読あり
• [雑誌論文] Blood group P1 antigen?bearing glycoproteins are functional but less efficient receptors of Shiga toxin than conventional glycolipid-based receptors (2020)
  • 著者名/発表者名: Morimoto K, Suzuki N, Tanida I, Kakuta S, Furuta Y, Uchiyama Y, Hanada K, Suzuki Y, Yamaji T.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 295 号: 28 ページ: 9490-9501
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.013926
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparative characterization of flavivirus production in two cell lines: Human hepatoma-derived Huh7.5.1-8 and African green monkey kidney-derived Vero (2020)
  • 著者名/発表者名: Kyoko Saito, Masayoshi Fukasawa, Yoshitaka Shirasago, Ryosuke Suzuki, Naoki Osada, Toshiyuki Yamaji, Takaji Wakita, Eiji Konishi, Kentaro Hanada
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 15 号: 4 ページ: e0232274-e0232274
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0232274
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Preparation of Fluorescent Recombinant Shiga Toxin B Subunit and Its Application to Flow Cytometry (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamaji T
  • 雑誌名: Methods Mol Biol, 巻: 2132 ページ: 463-474
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0430-4_45
  • ISBN: 9781071604298, 9781071604304
• [雑誌論文] A CRISPR Screen Using Subtilase Cytotoxin Identifies SLC39A9 as a Glycan-Regulating Factor (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamaji Toshiyuki、Hanamatsu Hisatoshi、Sekizuka Tsuyoshi、Kuroda Makoto、Iwasaki Norimasa、Ohnishi Makoto、Furukawa Jun-ichi、Yahiro Kinnosuke、Hanada Kentaro
  • 雑誌名: iScience 巻: 15 ページ: 407-420
  • DOI: 10.1016/j.isci.2019.05.005
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Chlamydia trachomatis‐infected human cells convert ceramide to sphingomyelin without sphingomyelin synthases 1 and 2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Tachida Yuriko、Kumagai Keigo、Sakai Shota、Ando Shuji、Yamaji Toshiyuki、Hanada Kentaro
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 594 号: 3 ページ: 519-529
  • DOI: 10.1002/1873-3468.13632
  • 査読あり
• [雑誌論文] 哺乳動物のセラミド関連脂質生合成 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 雑誌名: セラミド研究の新展開～基礎から応用へ～ 巻: 0 ページ: 22-31
• [雑誌論文] A CRISPR screen identifies LAPTM4A and TM9SF proteins as glycolipid-regulating factors (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamaji T, Sekizuka T, Tachida Y, Sakuma C, Morimoto K, Kuroda M, Hanada K
  • 雑誌名: iScience 巻: 11 ページ: 409-424
  • DOI: 10.1016/j.isci.2018.12.039
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nanotubes connecting B lymphocytes: High impact of differentiation-dependent lipid composition on their growth and mechanics (2017)
  • 著者名/発表者名: Toth EA, Oszvald A, Peter M, Balogh G, Osteikoetxea- Molnar A, Bozo T, Szabo-Meleg E, Nyitrai M, Derenyi I, Yamaji T, Hanada K, Vigh L, Matko J
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta 巻: 1862 号: 9 ページ: 991-1000
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2017.06.011
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] ゲノム編集法を用いた生体膜脂質や糖鎖の代謝及び感染症研究 (2021)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 学会等名: 東京医科歯科大学大学院特別セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 8.Modulation of Zika virus replication via glucosylceramide 1 synthase and glycosphingolipids (2021)
  • 著者名/発表者名: Brown M, Cerone J, Ogbamikael S, Yager E, Yamaji T, Barroso M, Hanada K, Konan K
  • 学会等名: Eastern Society for Pediatric Research Annual Meeting ESPR2021
  • 国際学会
• [学会発表] Application of genome editing technologies to studies on sphingolipid biology (2021)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 学会等名: 第141回日本薬学会
  • 招待講演
• [学会発表] 小胞体-ゴルジ体連携ゾーンにおけるCERTの機能制御に関する因子の探索 (2020)
  • 著者名/発表者名: 水池彩、酒井祥太、山地俊之、花田賢太郎
  • 学会等名: 第62回脂質生化学会
• [学会発表] ヒト脳脊髄液にはガラビオシルセラミド（Gb2）が存在する (2020)
  • 著者名/発表者名: 秋山央子、井出三津子、山地俊之、植田晃広、新美芳樹、武藤多津郎、上口裕之、平林義雄
  • 学会等名: 第62回脂質生化学会
• [学会発表] スフィンゴ脂質のC型肝炎ウイルス複製における役割の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 相崎英樹、青柳東代、若江亨祥、有田峰太郎、渡士幸一、鈴木亮介、熊谷圭悟、山地俊之、深澤征義、村松正道、脇田隆字、花田賢太郎
  • 学会等名: 第62回脂質生化学会
• [学会発表] P1糖鎖エピトープを有する糖タンパク質の志賀毒素受容体としての機能解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 森本貫太、鈴木詔子、谷田以誠、角田宗一郎、古田陽子、内山安男、花田賢太郎、鈴木佑典、山地俊之
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会年会
• [学会発表] ヒトマクロファージの免疫応答における極長鎖脂肪酸鎖を含むスフィンゴ脂質の役割 (2020)
  • 著者名/発表者名: 花房慶、中山仁志、山地俊之、岩渕和久
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会年会
• [学会発表] ゲノムワイドスクリーニングによって同定された糖鎖発現制御因子の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之、 関塚剛史、花松久寿、黒田誠、古川潤一、八尋錦之助、花田賢太郎
  • 学会等名: 第38回日本糖質学会年会
• [学会発表] Genome-wide CRISPR screens identify novel glycan regulators (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Yamaji, Tsuyoshi Sekizuka, Hisatoshi Hanamatsu, Makoto Kuroda, Jun-ichi Furukawa, Kinnosuke Yahiro, Kentaro Hanada
  • 学会等名: 25th International Symposium on Glycoconjugates
  • 国際学会
• [学会発表] Application of genome editing technologies to studies on sphingolipid and glycan metabolisms (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshiyuki Yamaji
  • 学会等名: 1st Japan-Europe Workshop on Glycosphingolipids and Membrane homeostatsis
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] P1糖鎖エピトープを有した糖タンパク質の志賀毒素受容体としての機能解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 森本貫太、鈴木詔子、花田賢太郎、鈴木佑典、山地俊之
  • 学会等名: 第92回日本生化学会大会
• [学会発表] CRISPRライブラリーを用いたSubtilase cytotoxinによる致死に耐性を示す細胞の樹立と受容体認識機構の解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: 八尋錦之助、大西真、花田賢太郎、山地俊之
  • 学会等名: 第23回腸管出血性大腸菌研究会
• [学会発表] ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングシステムのin silico解析webアプリケーション (2019)
  • 著者名/発表者名: 関塚剛史、佐久間智理、糸川健太郎、花田賢太郎、黒田誠、山地俊之
  • 学会等名: 第42回日本分子生物学会年会
• [学会発表] 糖鎖結合性細菌毒素を用いたゲノムワイドCRISPRスクリーニング (2019)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 学会等名: 第93回日本細菌学会総会
  • 招待講演
• [学会発表] Chlamydia trachomatisは細胞内寄生に宿主のスフィンゴミエリン生合成を必要としない (2018)
  • 著者名/発表者名: 立田由里子, 熊谷圭悟, 酒井祥太, 山地俊之, 花田賢太郎
  • 学会等名: 第60回日本脂質生化学会
• [学会発表] Chlamydia trachomatisは細胞内寄生に宿主のスフィンゴミエリン生合成を必要としない (2018)
  • 著者名/発表者名: 立田由里子, 熊谷圭悟, 酒井祥太, 山地俊之, 花田賢太郎
  • 学会等名: 第11回セラミド研究会
• [学会発表] 遺伝子編集法を用いた宿主細胞因子の探索及び糖鎖生合成研究への応用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 学会等名: 第16回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集法を用いた糖鎖・脂質代謝関連因子の探索 (2018)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之
  • 学会等名: 第2回オルガネラゾーン研究会
  • 招待講演
• [学会発表] Genome-Wide CRISPR Screening for Identifying Genes Involved in Glycolipid Metabolism (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaji T, Hanada K
  • 学会等名: Gordon Research Conference on Glycolipid and Sphingolipid Biology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] CRISPRライブラリーを用いた志賀毒素の細胞障害作用に対するゲノムワイドスクリーニング (2017)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之、立田由里子、佐久間智理、関塚剛史、黒田誠、花田賢太郎
  • 学会等名: 第59回日本脂質生化学会
• [学会発表] CRISPRライブラリーを用いた糖脂質生合成に影響を及ぼす因子の探索 (2017)
  • 著者名/発表者名: 山地俊之、関塚剛史、佐久間智理、立田由里子、黒田誠、花田賢太郎
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会 第40回日本分子生物学会年会・第90回日本生化学会大会
  • 招待講演