次世代型トランスポーター解析法の構築に基づくヒトの４大中枢関門の生理的役割の解明

• 研究課題/領域番号: 18KK0446
• 研究種目: 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(A))
• 配分区分: 基金
• 研究分野: 医療系薬学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 内田 康雄 東北大学, 薬学研究科, 准教授 (70583590)
• 研究期間 (年度): 2019 – 2023
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 15,600千円 (直接経費: 12,000千円、間接経費: 3,600千円)
• キーワード: 血液クモ膜関門 / PICK法 / TM7SF3/LHFPL6 / 再構築 / SWATH法 / 網羅的局在解明 / SWATH / OCT2 / MATE1 / OAT1 / OAT3 / 血液脳関門 / 輸送担体探索 / qGAP法 / qTAP法 / プロテオミクス / トランスポーター / メタボロミクス

研究開始時の研究の概要

末梢と中枢組織の間には、中枢関門が存在する。本研究では、最先端オミクス技術を有するスイス連邦工科大学分子システム生物学研究所との共同研究によって、トランスポーターの探索・局在解析・基質探索及び生理的役割解明を一挙に達成できる「次世代型トランスポーター解析基盤」を構築し、中枢機能の恒常性維持のために中枢関門がどのような生理的役割を果たしているかを解明することを目的とする。

研究実績の概要

中枢関門細胞の輸送担体の機能解析を行う上で、効率よく遺伝子導入できる技術は有用である。従来のリポフェクション法は、導入効率が悪く、導入される細胞の割合は、全体の10%以下であった。対照的に、ssPalm脂質を用いたナノ粒子に遺伝子を搭載し導入した場合、95％の細胞に導入することに成功した。各種in vitro系やin vivo系を用いた解析によって、血液クモ膜関門のoat1/slc22a6やoat3/slc22a8は有機アニオンの脳脊髄液からの排出に寄与することが明らかとなった。定量プロテオミクスSWATH法とクロスリンク法を融合させることによって、目的の化合物を輸送する輸送担体を効率よく同定する手法「Proteomics-based Identification of transporter by Crosslinking substrate in Keyhole (PICK)」法を開発した。血液脳関門において有機カチオン性化合物を脳内へ供給輸送する新規輸送担体複合体TM7SF3/LHFPL6を発見し、輸送特性を決定した。論文発表済みである。また、いくつかの輸送担体について、高発現させたin vitro細胞株とその親細胞株（発現させていない）を用いて、基質である化合物に対する輸送速度を計測し、高発現株と親細胞株の差からトランスポーターの輸送活性を求めた。最新の液体クロマトグラフィ接続型質量分析装置を用いて、その細胞株における該当トランスポータータンパク質の存在量を定量した。輸送活性を存在量で割ることによって、1 molあたりの輸送活性を解明した。1 molあたりの輸送活性を、血液脳関門におけるトランスポーターのタンパク質存在量(mol)と統合することによって、in vivo血液脳関門での輸送活性を再構築した。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

新型コロナウィルス感染症の流行のため、依然としてスイスへ渡航できていないが、方針を変更して、Web会議等でスイス連邦工科大学の共同研究者と密に連携することや、日本のラボに装置を導入することによって、渡航することなく、計画を前に進めることができた。

今後の研究の推進方策

新規に探索された輸送担体についてin vitroおよびin vivoでの実験・解析を進め、中枢関門の生理学的役割を解明する方針である。

研究成果

• [雑誌論文] Characterization of proteome profile data of chemicals based on data-independent acquisition MS with SWATH method (2023)
  • 著者名/発表者名: Ishiguro H, Mizuno T, Uchida Y, Sato R, Sasaki H, Nemoto S, Terasaki T, Kusuhara H
  • 雑誌名: NAR Genom Bioinform 巻: 5(1) 号: 1
  • DOI: 10.1093/nargab/lqad022
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] pH-Responsive Lipid Nanoparticles Achieve Efficient mRNA Transfection in Brain Capillary Endothelial Cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Sakurai Y, Watanabe H, Nishio K, Hashimoto K, Harada A, Gomi M, Suzuki M, Oyama R, Handa T, Sato R, Takeuchi H, Taira R, Tezuka K, Tange K, Nakai Y, Akita H, Uchida Y
  • 雑誌名: Pharmaceutics 巻: 14(8) 号: 8 ページ: 1560-1560
  • DOI: 10.3390/pharmaceutics14081560
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Proteomics-Based Transporter Identification by the PICK Method: Involvement of TM7SF3 and LHFPL6 in Proton-Coupled Organic Cation Antiport at the Blood?Brain Barrier (2022)
  • 著者名/発表者名: Kurosawa Toshiki、Tega Yuma、Uchida Yasuo、Higuchi Kei、Tabata Hidetsugu、Sumiyoshi Takaaki、Kubo Yoshiyuki、Terasaki Tetsuya、Deguchi Yoshiharu
  • 雑誌名: Pharmaceutics 巻: 14 号: 8 ページ: 1683-1683
  • DOI: 10.3390/pharmaceutics14081683
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A Human Blood-Arachnoid Barrier Atlas of Transporters, Receptors, Enzymes, Tight Junction and Marker Proteins: Comparison with Dog and Pig in Absolute Abundance (2022)
  • 著者名/発表者名: Uchida Y, Takeuchi H, Goto R, Braun C, Fuchs H, Ishiguro N, Takao M, Tano M, Terasaki T
  • 雑誌名: J Neurochem 巻: - 号: 2 ページ: 187-208
  • DOI: 10.1111/jnc.15599
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pharmacoproteomics of Brain Barrier Transporters and Substrate Design for the Brain Targeted Drug Delivery (2022)
  • 著者名/発表者名: Huttunen KM, Terasaki T, Urtti A, Montaser AB, Uchida Y
  • 雑誌名: Pharm Res 巻: - 号: 7 ページ: 1363-1392
  • DOI: 10.1007/s11095-022-03193-2
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Regional Differences in the Absolute Abundance of Transporters, Receptors and Tight Junction Molecules at the Blood-Arachnoid Barrier and Blood-Spinal Cord Barrier among Cervical, Thoracic and Lumbar Spines in Dogs (2022)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi H, Suzuki M, Goto R, Tezuka K, Fuchs H, Ishiguro N, Terasaki T, Braun C, Uchida Y
  • 雑誌名: Pharm Res 巻: 39(7) 号: 7 ページ: 1393-1413
  • DOI: 10.1007/s11095-022-03275-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Quantitative Targeted Absolute Proteomics for Better Characterization of an In Vitro Human Blood-Brain Barrier Model Derived from Hematopoietic Stem Cells (2022)
  • 著者名/発表者名: Dehouck MP, Tachikawa M, Hoshi Y, Omori K, Maurage CA, Strecker G, Dehouck L, Boucau MC, Uchida Y, Gosselet F, Terasaki T, Karamanos Y
  • 雑誌名: Cells 巻: 11(24) 号: 24 ページ: 3963-3963
  • DOI: 10.3390/cells11243963
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] 輸送に関わる分子とその機能 (2022)
  • 著者名/発表者名: 赤川ラリブレダ、内田康雄
  • 雑誌名: 中外医学社Clinical Neuroscience 巻: 40(12) ページ: 1531-1534
• [雑誌論文] SWATH-Based Comprehensive Determination of the Localization of Apical and Basolateral Membrane Proteins Using Mouse Liver as a Model Tissue (2022)
  • 著者名/発表者名: Hirano S, Goto R, Uchida Y
  • 雑誌名: Biomedicines 巻: 10(2) 号: 2 ページ: 383-383
  • DOI: 10.3390/biomedicines10020383
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Quantitative Proteomics-Based Blood–Brain Barrier Study (2021)
  • 著者名/発表者名: Uchida Y.
  • 雑誌名: Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 巻: 44 号: 4 ページ: 465-473
  • DOI: 10.1248/bpb.b21-00001
  • NAID: 130008014244
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • 年月日: 2021-04-01
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An Atlas of the Quantitative Protein Expression of Anti- Epileptic-Drug Transporters, Metabolizing Enzymes and Tight Junctions at the Blood-Brain Barrier in Epileptic Patients (2021)
  • 著者名/発表者名: Sato R, Ohmori K, Umetsu M, Takao M, Tano M, Grant G, Porter B, Bet A, Terasaki T, Uchida Y
  • 雑誌名: Pharmaceutics 巻: 13(12) 号: 12 ページ: 2122-2122
  • DOI: 10.3390/pharmaceutics13122122
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of absolute protein abundances of transporters and receptors among blood-brain barriers at different cerebral regions and blood-spinal cord barrier in human and rat. (2020)
  • 著者名/発表者名: Uchida Y, Yagi Y, Takao M, Tano M, Umetsu M, Hirano S, Usui T, Tachikawa M, Terasaki T.
  • 雑誌名: Mol Pharm 巻: 17(6) 号: 6 ページ: 2006-2020
  • DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.0c00178
  • 査読あり
• [雑誌論文] Abundant Expression of OCT2, MATE1, OAT1, OAT3, PEPT2, BCRP, MDR1, and xCT Transporters in Blood-Arachnoid Barrier of Pig and Polarized Localizations at CSF- and Blood-Facing Plasma Membranes. (2020)
  • 著者名/発表者名: Uchida Y, Goto R, Takeuchi H, Luczak M, Usui T, Tachikawa M, Terasaki T.
  • 雑誌名: Drug Metab Dispos 巻: 48(2) 号: 2 ページ: 135-145
  • DOI: 10.1124/dmd.119.089516
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of absolute protein abundances of transporters and receptors among blood-brain barriers at different cerebral regions and blood-spinal cord barrier in human and rat (2020)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida, Y Yagi, M Takao, M Tano, M Umetsu, S Hirano, T Usui, M Tachikawa, and T Terasaki
  • 雑誌名: Mol Pharm 巻: -
  • 査読あり
• [雑誌論文] 4つの中枢関門の分子機構の解明に基づくヒトの脳内薬物濃度の予測と中枢疾患の新たな創薬フィールドの開拓 (2020)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 雑誌名: 薬事日報 巻: 12286
• [雑誌論文] Physiological and pharmacological roles of “Blood-Arachnoid Barrier”, a new interface of central nervous system: Importance of quantitative proteomics to open up a new world (2020)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida
  • 雑誌名: Proteome Letters 巻: 1
  • NAID: 130007891646
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitative Protein Expression in the Human Retinal Pigment Epithelium: Comparison Between Apical and Basolateral Plasma Membranes With Emphasis on Transporters. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hellinen L, Sato K, Reinisalo M, Kidron H, Rilla K, Tachikawa M, Uchida Y, Terasaki T, Urtti A.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci 巻: 60(15) 号: 15 ページ: 5022-5034
  • DOI: 10.1167/iovs.19-27328
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Distinct roles of ezrin, radixin and moesin in maintaining the plasma membrane localizations and functions of human blood-brain barrier transporters (2019)
  • 著者名/発表者名: Hoshi Yutaro、Uchida Yasuo、Kuroda Takashi、Tachikawa Masanori、Couraud Pierre-Olivier、Suzuki Takashi、Terasaki Tetsuya
  • 雑誌名: Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 巻: - 号: 7 ページ: 1533-1545
  • DOI: 10.1177/0271678x19868880
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Toward a Consensus on Applying Quantitative Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Proteomics in Translational Pharmacology Research: A White Paper. (2019)
  • 著者名/発表者名: Prasad B, Achour B, Artursson P, Hop CECA, Lai Y, Smith PC, Barber J, Wisniewski JR, Spellman D, Uchida Y, Zientek MA, Unadkat JD, Rostami-Hodjegan A.
  • 雑誌名: Clin Pharmacol Ther. 巻: 106(3) 号: 3 ページ: 525-543
  • DOI: 10.1002/cpt.1537
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Amyloid beta(25-35) impairs docosahexaenoic acid efflux by down-regulating fatty acid transport protein 1 (FATP1/SLC27A1) protein expression in human brain capillary endothelial cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ochiai Y, Uchida Y, Tachikawa M, Couraud PO, Terasaki T.
  • 雑誌名: J Neurochem. 巻: 150(4) 号: 4 ページ: 385-401
  • DOI: 10.1111/jnc.14722
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] 中枢疾患時の血液脳関門P糖タンパク質の機能変動機構の解明と中枢関門創薬への新展開 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄、臼井拓也、寺崎哲也
  • 雑誌名: 医学のあゆみ 巻: 271(1) ページ: 104-111
• [雑誌論文] 次世代型定量プロテオミクスに基づく中枢関門の新規密着結合分子の同定および多発性硬化症の中枢関門破綻への関与 (2019)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 雑誌名: ファルマシア 巻: 55 ページ: 320-324
  • NAID: 130007621940
• [雑誌論文] Uniprotデータベース (2019)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 雑誌名: ファルマシア 巻: 55
  • NAID: 130007621935
• [学会発表] 次世代型定量プロテオミクスが拓く中枢関門研究の新地平 (2023)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 第6回日本質量分析学会東北談話会
  • 招待講演
• [学会発表] 新技術で拓かれる新たな中枢関門の正体 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 日本薬剤学会第37年会
  • 招待講演
• [学会発表] Next generation quantitative proteomics and its application to metal transport study (2022)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代型プロテオミクスで拓かれる新たな中枢関門の正体 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 第21 回医療薬学若手研究者セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 次世代型定量プロテオミクスによって拓かれる中枢関門研究の新地平 (2022)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 学術変革領域「脳分子探査」セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] 血液脳関門に高発現するトランスポーターMFSD10の新規基質探索 (2022)
  • 著者名/発表者名: 赤川ラリブレダ、佐藤哲、神戸大朋 、内田康雄
  • 学会等名: 第61回日本薬学会東北支部大会
• [学会発表] 血液脳関門 MFSD10 による薬物の脳移行性と中枢作用の制限 (2022)
  • 著者名/発表者名: 佐藤哲、赤川ラリブレダ、内田康雄
  • 学会等名: 第61回日本薬学会東北支部大会
• [学会発表] 亜鉛輸送をはじめとする肝臓トランスポーター群のタンパク質絶対発現量と局在の網羅的解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 内田 康雄, 平野 誠巳, 寺崎 哲也
  • 学会等名: 生命金属科学 夏の合宿
• [学会発表] ヒト、ブタ血液クモ膜関門におけるタンパク質発現量解析及び輸送担体細胞膜局在の一斉解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 竹内妃奈、後藤諒平、Magdalena Luczak、臼井拓也、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也、内田康雄
  • 学会等名: 日本医用マススペクトル学会第46回年会
• [学会発表] quantitative Global Absolute Proteomics （qGAP）法を用いたヒト脳毛細血管内皮細胞株（hCMEC/D3細胞）のヒト血液脳関門モデルとしての特性評価 (2021)
  • 著者名/発表者名: 平良怜雅、平野誠巳、池田千絵美、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也、内田康雄
  • 学会等名: 日本薬剤学会第36年会
• [学会発表] P-glycoprotein activation at the blood-brain barrier as a new potential therapy of brain infarct (2020)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida
  • 学会等名: the 23rd North American ISSX and 35th JSSX Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Next generation quantitative proteomics opens up the new fields of CNS barrier studies (2020)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida
  • 学会等名: Cerebral Vascular Biology Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] (永井財団大学院学生スカラシップ採択) 定量プロテオミクスによるヒト血液クモ膜関門における薬物輸送担体及び薬物代謝酵素の網羅的発現量解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 竹内妃奈、臼井拓也、後藤諒平、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也、内田康雄
  • 学会等名: 日本薬剤学会第35年会
• [学会発表] ヒト血液脳脊髄液関門を介した高分子輸送経路の網羅的探索: 脳室への薬物送達における葉酸受容体αの有用性 (2020)
  • 著者名/発表者名: 臼井拓也、竹内妃奈、平野誠巳、三城智人、後藤諒平、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也、内田康雄
  • 学会等名: 日本薬剤学会第35年会
• [学会発表] 定量プロテオミクスに基づく血液脳関門の輸送機能および病態変動機構の解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄（日本薬学会奨励賞受賞講演）
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会
  • 招待講演
• [学会発表] 定量プロテオミクスを用いたヒト脈絡叢における膜タンパク質の網羅的発現解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 臼井拓也、内田康雄、後藤諒平、三城智人、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会
• [学会発表] SWATH定量プロテオミクスに基づくヒト小児てんかんの焦点部位における血液脳関門と脳実質組織の病態変動機構の網羅的解明 (2020)
  • 著者名/発表者名: 佐藤理沙、内田康雄、大森広太郎、梅津美奈、Gerald Grant、Brenda Porter、Anthony Bet、立川正憲、臼井拓也、寺崎哲也
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会
• [学会発表] 定量プロテオミクスによるヒト血液クモ膜関門における薬物輸送担体及び薬物代謝酵素の発現量解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 竹内妃奈、内田康雄、後藤諒平、臼井拓也、田野光敏、高尾昌樹、寺崎哲也
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会
• [学会発表] Laser Microdissectionを用いたホルマリン固定パラフィン包埋切片の病変部位特異的なプロテオミクス定量系の確立：胆管結紮マウス肝臓のタンパク質発現量変動解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 半田拓巳、内田康雄、佐々木颯、臼井拓也、寺崎哲也
  • 学会等名: 日本薬学会 第140年会
• [学会発表] Key Issues and Our Solutions in Transporter Proteomics (2019)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida
  • 学会等名: The Seminar of University of Eastern Finland, School of Pharmacy
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Blood-brain barrier P-glycoprotein activation as a new potential therapy of brain infarct (2019)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida
  • 学会等名: 34th JSSX annual conference
  • 招待講演
• [学会発表] Anti-epileptic drug metabolizing enzymes are upregulated at the blood-brain barrier in pharmacoresistant childhood epilepsy: SWATH-based comprehensive quantitative proteomic study (2019)
  • 著者名/発表者名: R Sato, Y Uchida, K Omori, M Umetsu, G Grant, B Porter, A Bet, M Tachikawa, T Usui, and T Terasaki
  • 学会等名: 34th JSSX annual conference
• [学会発表] (英語口頭発表部門で優秀口頭発表賞を受賞（47演題中4演題）学部4年生が受賞するのは快挙) OCT2 protein is expressed in CSF side of the porcine blood-arachnoid barrier, while MATE1 is in blood side: Application of qTAP to transporter localization (2019)
  • 著者名/発表者名: H Takeuchi, Y Uchida, R Goto, M Luczak, T Usui and T Terasaki
  • 学会等名: 34th JSSX annual conference
• [学会発表] Next generation quantitative proteomics “SWATH-MS法” (2019)
  • 著者名/発表者名: 内田康雄
  • 学会等名: 東京大学大学院薬学系研究科セミナー
  • 招待講演
• [学会発表] (永井財団大学院学生スカラシップ採択) 網羅的かつ高精度なトランスポーター基質探索に向けたカクテル輸送実験におけるSWATH一斉定量法の評価 (2019)
  • 著者名/発表者名: 笠森なな、内田康雄、寺崎哲也
  • 学会等名: 日本薬剤学会第34年会
• [学会発表] (口頭発表部門で優秀発表賞を受賞) 脈絡叢と脳軟髄膜の標的プロテオミクス解析：ブタ1 頭あたりの脈絡叢と脳軟髄膜におけるトランスポータータンパク質の発現量解析と膜タンパク質の膜局在の網羅的解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: 後藤諒平、内田康雄、竹内妃奈、Magdalena Luczak、臼井拓也、立川正憲、寺崎哲也
  • 学会等名: 第41回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
• [学会発表] 薬剤耐性型てんかん患者の血液脳関門で薬物代謝酵素が発現上昇する。 (2019)
  • 著者名/発表者名: 佐藤理沙、内田康雄、大森広太郎、梅津美奈、Gerald Grant、Brenda Porter、Anthony Bet、立川正憲、臼井拓也、寺崎哲也
  • 学会等名: 第58回日本薬学会東北支部大会
• [学会発表] ブタ血液クモ膜関門におけるトランスポーター13分子の局在一斉解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: 竹内妃奈、内田康雄、後藤諒平、Magdalena Luczak、臼井拓也、寺崎哲也
  • 学会等名: 第58回日本薬学会東北支部大会
• [図書] Drug Delivery to the Brain - Physiological Concepts, Methodologies and Approaches - The second edition (2022)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida, R Goto, T Usui, M Tachikawa and T Terasaki
  • 総ページ数: 812
  • 出版者: Springer
• [図書] Blood-arachnoid barrier as a dynamic physiological and pharmacological interface between cerebrospinal fluid and blood (2020)
  • 著者名/発表者名: Y Uchida, R Goto, T Usui, M Tachikawa and T Terasaki
  • 出版者: Springer
• [備考] 内田研究室ホームページ
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/pharm/research/lab/Pharmaceutics_and_Therapeutics
• [備考] 研究代表者ホームページ（内田康雄）
  • URL: http://www.pharm.tohoku.ac.jp/~soutatsu/drug_design/
• [備考] 研究代表者ホームページ（内田康雄）
  • URL: http://www.pharm.tohoku.ac.jp/~soutatsu/dds/profile/uchida.htm