| 研究課題/領域番号 |
19H01068
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
中区分57:口腔科学およびその関連分野
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
青木 和広 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (40272603)
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| 研究分担者 |
林 智広 東京工業大学, 物質理工学院, 准教授 (30401574)
本間 雅 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60401072)
秋吉 一成 京都大学, 工学研究科, 教授 (90201285)
宇田川 信之 松本歯科大学, 歯学部, 教授 (70245801)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
44,980千円 (直接経費: 34,600千円、間接経費: 10,380千円)
2022年度: 12,090千円 (直接経費: 9,300千円、間接経費: 2,790千円)
2021年度: 11,440千円 (直接経費: 8,800千円、間接経費: 2,640千円)
2020年度: 11,570千円 (直接経費: 8,900千円、間接経費: 2,670千円)
2019年度: 9,880千円 (直接経費: 7,600千円、間接経費: 2,280千円)
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| キーワード | 骨形成促進薬 / 骨芽細胞 / RANKL逆シグナル / プロテオリポソーム / ペプチド創薬 / AFM / 抗体改編技術 / RANKL結合ペプチド / RANK搭載膜小胞 / 原子間力顕微鏡 / 膜小胞 / プロテオリポソーム技術 / 骨形成促進剤開発 / 人工エクソソーム / 骨形成活性 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
歯科医療では局所に骨誘導できる薬剤の開発が求められている。我々は骨形成促進作用を持つ分子量が1000～2000ほどのペプチドにより、観血処置をせずに注射で骨を誘導する方法を見出したが、BMP-2という骨形成促進タンパクの助けを借りていた。BMP-2は作用部位の腫脹など様々な問題が指摘されており、日本ではまだ承認されていない。本研究では、BMP-2に代わるRANKLという分子に結合する新規骨形成促進剤を生み出すための基礎的研究基盤を構築し、研究成果が広く歯科医療に還元できる研究を推進する。
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| 研究実績の概要 |
我々は局所の骨形成促進因子Bone morphogenetic protein(BMP)-2に代わる創薬候補として、receptor activator of NF-kB ligand (RANKL)分子に結合するペプチドを開発してきた。RANKL結合ペプチドの骨形成促進メカニズムは、骨を造る細胞に発現するRANKL分子への直接刺激によると考えられている。この刺激は、通常リガンドとして働く細胞上のRANKL分子が、受容体として働くため、“RANKL逆シグナル”と呼んでいる。
2020年度の特筆すべき研究実績は、本基盤研究の研究者と研究協力者との共同研究が進み、ヒトRANKLに結合する新規ペプチドがスクリーニングされてきたことである。スクリーニングされてきたペプチドはヒトRANKL添加による破骨細胞形成を効率良く抑制した。また、この新規RANKL結合ペプチドは、従来のRANKL結合ペプチドであるWP9QY（W9）ペプチドの10倍から100倍高いRANKL親和性を示すデータを得ている。しかしながら、このペプチドはヒトRANKL特異的に結合するため、マウスRANKLには結合しない。従来のST2などマウス由来細胞株では骨形成促進作用を検討することができないため、今後動物を用いた解析を進めるにあたり、今後の研究の推進方策に記した工夫が必要である。
一方、ヒトRANKL特異的に結合するペプチドの細胞を用いた解析を進めるにあたり、ヒトRANKL分子を発現するヒト骨肉腫由来の細胞株SaOS2を用いて、細胞分化が促進するかの検討を行った。この株細胞は細胞上のRANKLに結合するリガンド刺激により、分化が抑制されることが分かった。この結果は、RANKLをトランスフェクションしても同様であった。今後の創薬候補の薬効解析に備えたin vivo in vitro 実験準備が進んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新規RANKL結合ペプチドの創出は行うことができたが、一方で、当初から試みているプロテオリポソーム（タンパク質をリポソームに載せる）技術による新規骨形成促進因子の創出には時間がかかっている。RANKLの相手方であるマウスRANKを搭載したリポソーム（脂質２重膜をもつ膜小胞）による骨形成促進を試みているが、２０１９年度に続き、芳しい成果はまだ得られていない。
一方、RANKL分子に結合する分子による骨形成促進シグナル（RANKL逆シグナル）は、骨形成細胞である骨芽細胞上に発現するRANKL量の増加とそれに伴うRANKL分子同士の会合（クラスター化）により活性化されることが明らかとなっている。RANKL逆シグナルをいれる最適なRANKL分子間距離が明らかとなれば、RANKL分子をターゲットとした新規骨形成促進薬をスクリーニングする時間を短縮することができる。このため、原子間力顕微鏡（AFM）を用いたRANKL分子の可視化を試みている。しかしながら、骨形成シグナルを入れるRANKL分子間距離がRANKL分子の可視化は、高速AFMをもちいた実験により可能であることを示したが、いまだに生きた細胞上のRANKL分子の可視化は、まだ成功していない。
このため、遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
主に3つの方策により、RANKLをターゲットとした骨形成促進薬の創出を目指す。
１．破骨細胞由来膜小胞に似せた骨形成促進薬の創出（秋吉、本間、宇田川、青木）
無細胞系で再構成されるマウスRANKタンパクの長さを工夫し、今一度、in vitroでRANKLとの結合能を検討したのち、骨芽細胞系のアッセイを行い、逆シグナルを入れるか否かを明らかにする。その後、マウスの骨欠損モデルを用いた動物実験で疑似膜小胞による骨形成促進作用をX線学的、組織学的に検討する。
2．ヒトRANKLに高い親和性を持つペプチドによる創薬（菅、本間、青木）
ヒトRANKLに特異的に結合するペプチドの薬効確認のため、用いるマウスは細胞外にヒトRANKL細胞内マウスRANKLを発現するキメラマウスを創出する。その後、上記と同様に頭蓋骨の骨欠損モデルを用いて新規RANKL結合ペプチドの骨形成促進作用を検討する。なお、RANKL結合ペプチドをスクリーニングされた菅 裕明先生（東京大・理学研究科）は研究協力者として引き続き参画される。
3．RANKL逆シグナルをいれる最適RANKL間距離の検討（林、菅、秋吉、本間、青木） 骨芽細胞に骨形成シグナルを入れる所謂RANKL逆シグナルの活性化条件を検討するために、RANKLが再構成されたリポソームを用いたAFM基盤上の修飾を行う。この修飾により、RANKLを発現する疑似脂質2重膜を作製し、新規骨形成促進剤によるRANKLのクラスター化を可視化する。本間先生が作製された逆シグナルを入れる抗体と入れない抗体を用いたり、以前より知られているRANKL逆シグナルをいれるリガンドを用いたりしながら、逆シグナルを入れる最適なRANKL間距離を明らかにし、RANKLをターゲットとした創薬の迅速スクリーニングを期待する。
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