プロトン構造とゆらぎの解析による銅アミン酸化酵素補酵素生合成機構の解明

• 研究課題/領域番号: 19K05694
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分37010:生体関連化学
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
• 研究分担者: 村川 武志 大阪医科薬科大学, 医学部, 助教 (90445990)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2021年度)
• 配分額: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円); 2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2020年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2019年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
• キーワード: 結晶構造解析 / 翻訳後修飾 / ゆらぎ / 補酵素 / 酵素 / 反応機構 / 銅アミン酸化酵素 / 金属イオン / 酸化反応 / 中性子構造解析

研究開始時の研究の概要

本研究は、銅含有アミン酸化酵素の自己触媒的な補酵素トパキノン（TPQ）の生成反応を対象として、酵素触媒反応に果たす金属イオンの役割の一端を詳細に解明することを目的とする。中性子結晶構造解析と高分解能X線結晶解析によって、LMCT中間体のプロトン座標とゆらぎの情報を獲得し、速度論解析と計算化学による解析を組み合わせることによって、LMCT中間体形成機構の詳細を明らかにする。最終的に、銅含有アミン酸化酵素の活性中心をひとつの酸化的反応場として捉え、各種の芳香族化合物においてLMCT中間体を形成させ、それを分子状酸素で酸化する新規酸化酵素を構築することをめざす。

研究成果の概要

本研究は、Arthrobacter globiformis由来銅含有アミン酸化酵素（AGAO）の自己触媒的な補酵素トパキノン（TPQ）の生成反応を対象として、酵素触媒反応に果たす金属イオンの役割の一端を詳細に解明することを目的とする。TPQ形成反応の初期に、TPQ前駆体Tyr残基において作り出されるligand-metal charge transfer（LMCT）中間体状態が作り出されることを、実験的に始めて証明した。また、反応中間状態を示す金属イオン結合型構造の中性子構造解析にも成功し、活性中心の残基のプロトン化状態に重要な知見を得た。

研究成果の学術的意義や社会的意義

銅アミン酸化酵素のTPQ形成反応において、分子全体のゆらぎの存在が重要であることが判明した。加えて、ligand-metal charge transfer（LMCT）中間体を含む各種の金属結合型反応中間体構造のX線結晶構造や中性子構造など、新規な構造情報を決定することができた。とりわけ、中性子構造は活性中心残基のプロトン座標について、実験的に明らかにすることに成功した。得られた結果は、銅アミン酸化酵素をベースとして、新規な酸化反応を引き起こす活性中心構造を作り出すために重要な情報となった。

研究成果

• [雑誌論文] Re-evaluation of protein neutron crystallography with and without X-ray/neutron joint refinement (2022)
  • 著者名/発表者名: Murakawa Takeshi、Kurihara Kazuo、Adachi Motoyasu、Kusaka Katsuhiro、Tanizawa Katsuyuki、Okajima Toshihide
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 9 号: 3 ページ: 342-348
  • DOI: 10.1107/s2052252522003657
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Microcrystal preparation for serial femtosecond X-ray crystallography of bacterial copper amine oxidase (2021)
  • 著者名/発表者名: Murakawa Takeshi、Suzuki Mamoru、Arima Toshi、Sugahara Michihiro、Tanaka Tomoyuki、Tanaka Rie、Iwata So、Nango Eriko、Tono Kensuke、Hayashi Hideyuki、Fukui Kenji、Yano Takato、Tanizawa Katsuyuki、Okajima Toshihide
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications 巻: 77 号: 10 ページ: 356-363
  • DOI: 10.1107/s2053230x21008967
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neutron Crystallography Reveals Unprecedented Active-site Structure in Copper Amine Oxidase (2021)
  • 著者名/発表者名: Murakawa Takeshi、Kurihara Kazuo、Tamada Taro、Kusaka Katsuhiro、Adachi Motoyasu、Okajima Toshihide
  • 雑誌名: J-PARC MLF ANNUAL REPORT 巻: 12 ページ: 14-16
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] X-Ray and Neutron Joint Refinement Displays Shared Proton and Keto Form of Quinone Cofactor in Copper Amine Oxidase (2021)
  • 著者名/発表者名: Murakawa Takeshi、Kurihara Kazuo、Kusaka Katsuhiro、Okajima Toshihide、Adachi Motoyasu
  • 雑誌名: Photon Factory Highlights 2020 巻: 6 ページ: 42-43
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Unique protonation states of aspartate and topaquinone in the active site of copper amine oxidase (2020)
  • 著者名/発表者名: Shoji Mitsuo、Murakawa Takeshi、Boero Mauro、Shigeta Yasuteru、Hayashi Hideyuki、Okajima Toshihide
  • 雑誌名: RSC Advances 巻: 10 号: 63 ページ: 38631-38639
  • DOI: 10.1039/d0ra06365g
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] In crystallo thermodynamic analysis of the catalytic reaction in bacterial copper amine oxidase (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murakawa, Seiki Baba,Toshihide Okajima
  • 雑誌名: SPring-8/SACLA Research Frontiers 2019 巻: 1 ページ: 20-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 宙に浮く水素イオン？！－大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界－（4月28日、プレス発表） (2020)
  • 著者名/発表者名: 村川武志、栗原和男、庄司光男、柴崎千枝、角南智子、玉田太郎、矢野直峰、山田太郎、日下勝弘、鈴木 守、重田育照、黒木良太、林 秀行、矢野貴人、谷澤克行、安達基泰、岡島俊英
  • 雑誌名: J-PARC News 巻: 181 ページ: 2-2
• [雑誌論文] In crystallo thermodynamic analysis of the catalytic reaction in bacterial copper amine oxidase (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murakawa, Seiki Baba, Toshihide Okajima
  • 雑誌名: SPring-8/SACLA Research Frontiers 巻: 印刷中
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neutron crystallography of copper amine oxidase reveals keto/enolate interconversion of the quinone cofactor and unusual proton sharing (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Murakawa, Kazuo Kurihara, Mitsuo Shoji, Chie Shibazaki, Tomoko Sunami, Taro Tamada, Naomine Yano, Taro Yamada, Katsuhiro Kusaka, Mamoru Suzuki, Yasuteru Shigeta, Ryota Kuroki, Hideyuki Hayashi, Takato Yano, Katsuyuki Tanizawa, Motoyasu Adachi, Toshihide Okajima
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 印刷中 号: 20 ページ: 10818-10824
  • DOI: 10.1073/pnas.1922538117
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 銅含有アミン酸化酵素触媒反応におけるコンホメーション変化のin crystallo熱力学解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 村川武志，馬場清喜，岡島俊英
  • 雑誌名: 生化学 巻: 91 号: 4 ページ: 565-571
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2019.910565
  • NAID: 40022022855
  • ISSN: 0037-1017
  • 年月日: 2019-08-25
  • 査読あり
• [学会発表] QM/MM法による銅アミン酸化酵素のプロトン化状態についての理論解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 庄司 光男、村川 武志、重田 育照、林 秀行、岡島 俊英
  • 学会等名: 第34回分子シミュレーション討論会
• [学会発表] 銅アミン酸化酵素のプロトン化状態についてのQM/MM解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 庄司 光男、村川 武志、重田 育照、林 秀行、岡島 俊英
  • 学会等名: 量子生命科学会第２回大会
• [学会発表] Neutron crystallography of copper amine oxidase: Novel protonated structure in the active site (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡島俊英
  • 学会等名: 錯体化学会第７０回討論会
  • 招待講演
• [学会発表] 銅アミン酸化酵素の高分解能中性子結晶構造と触媒反応機構 (2020)
  • 著者名/発表者名: 岡島俊英
  • 学会等名: 2020 年度iBIX-JAXA-KEK 物構研-QST 合同タンパク質研究会
  • 招待講演
• [学会発表] 銅アミン酸化酵素のトパキノン補酵素生合成反応における中間体形成の分光学的解析・速度論的解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 酒井克輝、佐々木康、村川武志、谷澤克行、岡島俊英
  • 学会等名: 日本農芸化学会2020年度大会
• [学会発表] Structural basis for conformational change of the topaquinone cofactor during the catalytic reaction of bacterial copper amine oxidase (2019)
  • 著者名/発表者名: Toshihide Okajima, Takeshi Murakawa, Seiki Baba, Satoshi Kanagawa, Hideyuki Hayashi, Takato Yano, Takashi Kumasaka, and Katsuyuki Tanizawa
  • 学会等名: 33rd Annual Symposium of The Protein Society
  • 国際学会
• [学会発表] 銅含有アミン酸化酵素触媒機構の“in crystallo” 熱力学的解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 村川武志
  • 学会等名: 第42回 SPring-8先端利用技術ワークショップ/大阪大学蛋白質研究所セミナー
  • 招待講演
• [備考] 銅アミン酸化酵素の中性子結晶構造解析に成功 ―宙に浮いているようにみえる水素イオンなど初めて解明
  • URL: https://www.ibaraki.ac.jp/news/2020/04/28010784.html
• [備考] 宙に浮く水素イオン？！ ―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2020/20200428_1
• [備考] 宙に浮く水素イオン？！ ―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/hot_topics/topics_20200428/
• [備考] 宙に浮く水素イオン？！―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: https://www.ccs.tsukuba.ac.jp/release-20200428/
• [備考] 宙に浮く水素イオン？！―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: http://www.tsukuba.ac.jp/attention-research/p202004280400.html
• [備考] 宙に浮く水素イオン？! 大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界
  • URL: https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2020/20200428_1
• [備考] 宙に浮く水素イオン？！ ―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/hot_topics/topics_20200428/
• [備考] 宙に浮く水素イオン?! ―大型タンパク質の中性子結晶構造解析で見えた特異な世界―
  • URL: https://www.osaka-med.ac.jp/news/research/f2pjgc000000fjnt.html