| 研究課題/領域番号 |
19K06555
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
横田 亜紀子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20415764)
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| 研究分担者 |
野田 尚宏 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (70415727)
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| 研究期間 (年度) |
2020-02-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2020年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2019年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | w/oエマルション / 変異ライブラリ / ドロップレット / スクリーニングシステム / 蛍光検出 / タンパク質-核酸相互作用 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究においては、無細胞タンパク合成系などを利用した変異ライブラリと、w/oエマルション等を利用したスクリーニング系とを組み合わせ、目的機能を有する有用タンパク質を、迅速かつ簡便に探索する新しい手法を構築することを目指す。また、その成果として、多種多様な機能や特性を有する、新規もしくは改良型有用タンパク質分子の取得を目指す。さらに、それら取得したタンパク質分子を多角的かつ詳細に解析することで、生体内での作用機序に関する知見の獲得も目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究においては、変異ライブラリと、w/oエマルションを利用したスクリーニング系を組み合わせ、目的機能を有する有用タンパク質を迅速かつ簡便に探索する新しい手法の構築を目指している。今年度も、昨年度に引き続き、機能評価や変異効果の検出が比較的容易と考えられる蛍光タンパク質を用いたスクリーニングのモデル系の構築を試みた。昨年度、試行錯誤の末に蛍光タンパク（野生型）を発現する組換え大腸菌の作製に成功したが、これを出発点として、蛍光タンパクの変異ライブラリの構築を試みた。ランダム変異を導入して30クローンほどサンプリングして配列を確認したところ、多種多様な変異が導入されており、変異ライブラリの調製に成功したことが確認できた。そこで、この変異ライブラリをw/oエマルションに封入・培養し、クローンの特性の違い（変異効果）を、それらが発する蛍光の違いとしてソーティングできるかどうか、について検討を行った。個々のクローン（菌体）の特性を観察するために、1 エマルション当たりの封入菌体数が1以下（複数のクローンが混在しないように、シングルコロニーもしくは空）になるように菌体濃度を調整してエマルションに封入した。封入直後では、顕微鏡でもソーターでも蛍光は検出できず、培養開始から2日後に、ようやく蛍光の検出が可能となった。これは菌体1細胞の状態（封入当日、培養0日）では蛍光の検出が難しいことを意味している。次に、この培養開始2日後のエマルションを蛍光強度の違いでソーティングし、回収したエマルションを顕微鏡で観察した。その結果、1)蛍光を発する菌体が封入されたエマルション群、2)蛍光を発しない菌体が封入されたエマルション群、3)空のエマルション群、の３つに分離できることが分かった。次の段階として、変異導入の効果を蛍光強度や蛍光波長の変化として検出可能かどうかの検証を進めたいと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は、当初、予定していなかった別の業務が研究代表者に発生してしまったこと、実験補助員の雇用期間が当初の予定よりも短くなってしまったこと、など、想定外のマンパワー不足により実験が進まなかったことが挙げられる。ただし、研究そのものは、比較的順調に結果が出始めているので、もう1年間、期間を延長することで、さらに成果を積み上げたいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
「研究実績の概要」にも記載したように、今年度に得られた実験データと知見を活かして、蛍光タンパク変異ライブラリの組換え大腸菌を用いて、変異導入の効果を蛍光強度や蛍光波長の変化として検出することを試みる。エマルション（ドロップレット）に封入した状態で、ドロップレットソーターシステムあるいはドロップレットセレクターシステムを用いて、目的機能を持つクローンの分離・選択に挑戦し、高速スクリーニング系の構築を進めていきたいと考える。また、昨年度、変異導入クローンの取得に成功した配列特異的エンドリボヌクレアーゼについても、アッセイ系の構築や機能評価に関する検討を進めたいと考える。
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